3种海藻中岩藻聚糖的提取分离、结构表征及其对纤溶系统影响的研究

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本文以海蕴(Nemacystus decipiens)、江蓠(Gracilaria asiatica)以及石花菜(Gelidium amansii)为原料,采用脱脂后水提取和碱提取的方法,对这3种海藻中的多糖进行了提取分离,共得到12种粗多糖组分。利用高效凝胶渗透色谱(HPGPC)和高效液相色谱(HPLC)分别对其分子量和单糖组成进行了分析,结果表明,3种海藻中均有含量不等的岩藻糖,其中,海蕴多糖的岩藻糖含量最高,其热水提取多糖NW2只由岩藻糖和葡萄糖醛酸组成,摩尔比约为7:2。而江蓠和石花菜则以半乳糖为主且含有少量的葡萄糖和岩藻糖,其中,江蓠的冷水提取多糖GVC的岩藻糖含量最高(18%)。根据硫酸基含量测定结果,海蕴多糖的硫酸化程度普遍较高,其中又以NW2的硫酸基含量最高(20.3%),而4种江蓠多糖的硫酸基含量均不超过10%,石花菜多糖则以中性糖为主。另外,由分子量测定结果可以看出,各粗多糖的纯度较低,需要进一步的纯化。本文通用离子交换色谱,对粗多糖NW2和GVC进行了纯化,得到了组分NP1-4和GP1-3共7种纯品多糖,其中得率最高的分别为NP2和GP2,其分子量为487kD和1173kD,硫酸基含量为19.4%和5.77%,岩藻糖含量为77%和20%。通过以上分析,结合傅里叶变换红外光谱(FTIR)、核磁共振波谱(NMR)和甲基化分析结果表明, NP2为一种岩藻糖硫酸酯,岩藻糖以1,3连接为主链(约80%),2位上有葡萄糖醛酸支链(约20%),且通过1,2与主链连接。为了确定其细微结构,将NP2采用温和稀酸降解获得其寡糖混合物,经BioGel-P4柱分离获得8个寡糖组分,再通过电喷雾碰撞诱导串联质谱法(ESI-CID-MS/MS)对这8种硫酸岩藻寡糖进行了序列分析,确定其结构序列分别是:Fucp2S4Ac1→3Fucp,Fucp4S1→3Fucp4S, Fucp1→3(GlcUAp1→2) Fucp,Fucp2S4Ac1→3Fucp1→3Fucp, Fucp4S1→3(GlcUAp1→2)Fucp4Ac1→3Fucp,GluUAp1→2Fucp1→3(GlcUAp1→2)Fucp1→3Fucp,FucpSAc1→3Fucp1→3(GlcUAp1→2) Fucp1→3(GlcUAp1→2)Fucp1→3Fucp和FucpS1→3FucpAc1→3Fucp1→3(GlcUAp1→2)Fucp1→3FucpS1→3(GlcUAp1→2)Fucp1→3FucpS,硫酸基位于岩藻糖C2位和C4位羟基,乙酰基多位于岩藻糖的非还原端。寡糖结构分析进一步证明NP2是以1,3连接的岩藻糖为主链,葡萄糖醛酸通过1,2与主链连接。这些结构特殊的寡糖丰富了海洋寡糖库数据,并为进一步的糖生物芯片研究,探讨其与蛋白的相互作用提供了基础。在结构研究的基础上,以APTT、TT、PT为评价指标,评价了纯化多糖NP1-4和GP1-3的抗凝血活性,并通过测定UPA、T-PA、PAI-1的值,探讨了其对纤溶系统的影响,结果表明,多糖NP2、NP4和GP2有一定的抗凝血活性,而这些多糖均可提高t-PA/PAI-1,即促进纤溶酶原转化为纤溶酶,从而促进血栓的溶解,其中以NP2的效果最为显著,t-PA/PAI-1值约为空白的2.7倍,远高于肝素对照品。最后,将本文所得的各纯化多糖和寡糖组分,通过多糖的荧光标记和合成寡糖的拟糖脂,制备成糖生物学芯片,为寡糖药物的开发提供了理论。
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