论文部分内容阅读
昆虫的嗅觉在其生命活动过程中起着重要作用,许多研究表明气味结合蛋白(OBPs)参与了识别外界物质的第一步,但对于OBPs在昆虫中确切的生理功能并不是很清晰。稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis是水稻上重要的害虫,我们通过触角转录组测序,鉴定了多个CmedOBPs基因,但对于CmedOBPs在其嗅觉感受中的功能并不是很清晰。为此,本课题拟以稻纵卷叶螟为研究对象,在克隆其CmedOBPs基因及CmedOBPs基因表达模式分析的基础上,通过体外结合实验并结合RNAi技术,对CmedOBPs的功能进行探索,以期为明确稻纵卷叶螟寄主定位的分子机制提供依据。主要研究结果如下:1.稻纵卷叶螟翅和足的扫描电镜观察扫描电镜的结果显示,稻纵卷叶螟雌雄成虫翅上主要有非嗅觉感器鳞形和刺形两种感器。稻纵卷叶螟的足上除了嗅觉感器锥形和毛形感器外还有鳞形感器、刺形感器和Bohm鬃毛3种非嗅觉感器,数量统计显示前足感器多于后足,后足多于中足。雌雄翅及足上的感器无性二型现象。2.稻纵卷叶螟CmedOBPs基因克隆及序列分析本实验成功克隆出 CmedOBP5、CmedOBP8、CmedOBP10、CmedOBP13、CmedOBP14、CmedOBP20 共 6 个基因。序列分析发现 CmedOBP5、CmedOBP8 和CmedOBP14都有6个保守的半胱氨酸Cys,符合Classic OBPs的特征;而CmedOBP13有 7 个 Cys,CmedOBP10 有 15 个保守的 Cys,属于 Plus-C OBPs;CmedOBP20 有 5个Cys,属于Minus-C OBPs。信号肽预测结果表明,CmedOBP5、CmedOBP8、CmedOBP10、CmedOBP13、CmedOBP14、CmedOBP20 分别含有 18、17、20、22、25和16个信号肽。3.稻纵卷叶螟CmedOBPs基因的时空表达对上述6个基因在雌雄虫羽化后,交配未交配、各日龄段、各组织部位的表达量用荧光定量的方法进行分析。结果显示CmedOBP13、CmedOBP14、CmedOBP20主要在3日龄成虫触角(At)高表达,雌雄间有差异,可能主要行使化学感受的作用;其它3个基因在主要组织部位的表达量因成虫龄期、性别和交配状态的不同而有一定差异,CmedOBP5主要在1日龄雌雄成虫翅中(W)高表达;CmedOBP8主要高表达于雌雄成虫脂肪体(Fa);CmedOBP10主要在未交配的5日龄雌雄虫头部(H)高表达,可能行使其它生理功能。4.CmedOBP5和CmedOBP14的表达、纯化及结合特性分析以实验室已有载体构建了重组质粒pET-22b(+)-CmedOBP14、pET-22b(+)-CmedOB P5、pET-30a(+)-CmedOBP16、pET-30a(+)-CmedOBP20、pET-28a(+)-CmedOBP10 和 pE T-28a(+)-CmedOBP13。使其在表达菌株表达后,获得了纯蛋白CmedOBP5和CmedOB P14。荧光竞争结合实验结果显示,CmedOBP14与37种水稻挥发物的结合力除烷烃类和己醛外在中性条件下比在酸性条件下要强一些。除反-2-己醛,(-)-柠檬烯、3-蒈烯、橙花叔醇外,CmedOBP5在pH=7.4条件下与挥发物的结合力高于pH5.0。这可能与pH的不同引起OBPs不同的构象变化有关。选取与CmedOBP5结合能力较强的5种物质(侧柏烯、柏木脑、十六烷、顺-3-己烯醇、石竹烯)在16℃和27℃下进行荧光猝灭实验。结果显示柏木脑和顺-3-己烯醇与CmedOBP5呈稳定静态结合,计算其结合常数和结合位点,得出其作用力均为疏水作用力。5.行为活性物质的筛选查找文献发现在荧光竞争实验中与CmedOBP14结合能力较强的挥发物中有13种挥发物能导致稻纵卷叶螟产生强烈的电生理信号。为进一步了解CmedOBP14在稻纵卷叶螟嗅觉感受中的功能,利用触角电位(EAG)技术测定了注射dsCmedOBP14后,稻纵卷叶螟对挥发物的EAG反应。结果表明,注射dsRNA后稻纵卷叶螟成虫对橙花叔醇(Nerolidol)、柠檬燏((-)-Limonene)、β-紫罗兰酮(β-ionone)、十六烷(Hexadecane)、二十一烷(Henicosane)的EAG反应显著降低。利用H-型嗅觉仪,测定了稻纵卷叶螟对上述5种挥发物行为反应。结果表明,橙花叔醇、柠檬烯、十六烷和二十一烷等几种物质对稻纵卷叶螟具有显著的引诱作用,β-紫罗兰酮则具有趋避作用。注射dsCmedOBP14后,稻纵卷叶螟对橙花叔醇无明显的行为反应,但对柠檬烯、十六烷和二十一烷等三种物质仍表现出明显的趋向反应。CmedOBP14可能参与稻纵卷叶螟对橙花叔醇的识别。