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松树作为大宗植物资源,因其树皮内富含天然抗氧化剂一原花青素类化合物,具有很大的开发和增值潜力。本文通过比较华南地区常见的松科品种活性成分含量及抗氧化作用的差异,筛选出抗氧化活性最强的品种,对其活性成分的提取工艺进行优化。采用大孔吸附树脂进行分离富集、纯化,并通过色谱、核磁共振技术分离鉴定其中的原花青素。在此基础上深入研究了原花青素的抗氧化作用、抗癌作用及免疫活性。结果表明:
不同品种松树树皮活性含量和抗氧化性均存在较大的差异,马尾松树皮的总多酚含量、总黄酮含量、原花青素和水溶性多糖含量较高。松树皮中的总多酚含量和原花青素含量与其抗氧化活性之间存在显著的相关性和线性关系,相关系数均达到了极显著水平(P<0.01)。
利用单因素试验以及响应面设计(RSM)优化松树皮原花青素的提取工艺,实验验证结果与RSM预测值相符。
以大孔吸附树脂分离原花青素,对6种大孔吸附树脂的静态吸附和动态吸附性能比较,筛选出对马尾松树皮原花青素吸附性能较好的大孔吸附树脂为LSA-10,树脂吸附量较大、解吸率高、选择性好。用Langmuir单层吸附模型拟合比较各树脂的平衡速率常数,确定各树脂对原花青素的吸附为单层吸附。当上样流速为1mL/min,上样浓度10-12.5mg/mL,洗脱流速为1.5mL/min时分离纯化效果最好。最佳解吸剂为50%乙醇溶液。对其分级分离特性的研究表明,采用LSA-10树脂吸附分离原花青素在30%和50%乙醇浓度之间洗脱产物的纯度最高,达到84%以上,表明有效成分含量丰富。
用聚酰胺、SephadexLH-20凝胶色谱和制备Rp-HPLC液相色谱等分离手段对松树皮原花青素进行分离纯化,并用核磁共振技术进行化合物的结构鉴定。从原花青素提取物中分离出一种单体:(-)-表儿茶素;三种原花青素二聚体B<,2>,B<,4>,B<,5>;一种原花青素三聚体C<,1>;三种其它酚类物质:5,7,3,4-四羟基-(+)-二氢黄酮醇、3,4,5-三羟基芪和表没食子儿茶素没食子酸酯。表明原花青素提取物中除主要成分原花青素外,还存在其它酚类活性成分。
用MTT法分别测定对乳腺癌株MCF-7和肠癌株LOVO细胞和人胚肺成纤维细胞HELF正常的生长抑制情况。研究结果表明:原花青素能选择性抑制肿瘤细胞增值,而对癌细胞的生长抑制作用明显高于对正常人胚肺纤维细胞(HELF)的作用,提示这些化合物可以选择性地抑制癌细胞而对正常细胞影响比紫杉醇较小,可以作为抗癌药物替代品的开发。抗氧化活性表明,8种多酚化合物对DPPH、羟基、超氧阴离子自由基都有较强的清除活性,其清除DPPH效果显著优于槲皮素(P<0.05);其中清除羟基自由基能力按降序排列为5,7,3,4-四羟基-(+)-二氢黄酮醇>表儿茶素>B<,5>>B<,2>>3,4,5-三羟基芪>三聚体C<,1>>B<,4>>表没食子儿茶素没食子酸酯>槲皮素。清除超氧自由基能力按降序排列为5,7,3,4-四羟基-(+)-二氢黄酮醇>表儿茶素>B2>B5>3,4,5.三羟基芪>B4>三聚体Cl>表没食子儿茶素没食子酸酯>槲皮素。 8种多酚化合物均可抑制Fe<2+>引发的亚油酸过氧化,对亚油酸体系的抗氧化效果优于天然抗氧化剂V<,C>但低于V<,E>,并且都有不同程度、络合Fe<2+>能力。
免疫试验表明,松树皮8种多酚化合物都有不同程度的促进脾脏淋巴细胞增殖的效果。对照品芦丁浓度在不高于62.5μg/mL情况下,其脾脏淋巴细胞增殖结果与空白无显著不同(P<0.05)。当浓度达到125μg/mL时,才显示出增殖促进作用(P<0.05)。对于表儿茶素,B<,2>和C<,1>而言,本试验所采用的较低浓度1,5.5μg/mL,就可以显著促进脾脏淋巴细胞增殖(P<0.05)。对于B5及5,7,3,4-四羟基-(+)-二氢黄酮醇而言,当浓度达到31.25μg/mL/时,能显著(P<0.01)促进脾脏淋巴细胞增殖。