目的:当归为我国使用历史悠久的抗衰老中药,近年来被列为药食同源的物种之一,内含丰富的植物蛋白。当归蛋白具有原料易得、成本低、营养丰富、安全性高等特点,是一种优质的抗氧化肽来源,而目前对当归多肽类成分的研究较为匮乏。本文从抗氧化肽的角度出发,研究当归中多肽类成分的抗氧化活性,优化其制备工艺,筛选鉴定当归多肽中主要活性成分,并从量子化学、细胞生物学及分子对接、分子动力学方面初步探究当归多肽自由基清除机制及细胞铁死亡抑制作用机制。为丰富当归蛋白、多肽的研究内容及推动当归药材高值化利用提供理论参考。当归作为一种具有代表性的常见中药,当归多肽的系统性研究对其他中药抗氧化肽资源的开发也具有重要的借鉴意义。此外,本研究对抗氧化肽构效关系进行了初步探讨,以期为高活性抗氧化肽的筛选及结构修饰提供一定的参考。方法:本文首先采用凯氏定氮法测定当归脱脂粉中蛋白含量,并通过碱提酸沉及冷冻干燥法提取制备当归粗蛋白。对当归粗蛋白彻底酸水解,通过异硫氰酸苯酯（PITC）柱前衍生高效液相色谱法分析其氨基酸组成。其后,以水解度、自由基清除率为指标,筛选出当归蛋白抗氧化肽制备水解最佳用酶。利用响应面设计,优化当归蛋白酶解工艺,以最佳制备工艺获得当归酶解液AsPH。采用DPPH自由基、ABTS自由基、PTIO自由基、超氧阴离子自由基清除、铁离子还原、亚铁离子螯合等体外化学抗氧化实验评价了 AsPH的化学抗氧化活性。将AsPH通过超滤离心,获得分子量大小不同的组分。在活性导向原则指导下,进一步选择Sephadex G-25凝胶色谱分离得到的F2组分作为活性组分,供后续分析。借助超高效液相色谱-电喷雾/四级杆飞行时间串联质谱联用（UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS）技术鉴定F2组分中的肽段组成。将其中相对丰度较高的肽段与抗氧化关键蛋白Keap1进行分子对接模拟,并结合生物信息学预测,筛选出与蛋白受体结合能力较强及生物活性预测分数较高的肽段作为当归多肽主要活性成分,进行后续活性验证及机制分析。采用DPPH自由基与ABTS自由基清除法,对固相合成纯化的当归多肽进行抗氧化活性的评价与对比。利用密度泛涵理论进行量子化学计算,以探讨这些当归多肽自由基清除机制与构效关系。在此基础上,以erastin为诱导剂,建立小鼠海马神经元细胞系HT22细胞的铁死亡模型,以CCK-8法评价当归多肽对HT22细胞铁死亡的抑制活性。并借助DCFH-DA、C11-BODIPY荧光探针测定细胞内活性氧（ROS）及过氧化脂质（LPO）含量,探讨当归多肽对HT22细胞铁死亡的抑制作用机制。为验证当归多肽铁死亡抑制作用机制是否与Nrf2通路激活相关,使用Nrf2特异性抑制剂ML385联合作用于HT22细胞,观察ML385对各处理组细胞存活率及细胞内ROS及LPO含量变化。为进一步验证Nrf2通路在当归多肽抑制HT22细胞铁死亡中的作用机制,采用免疫荧光法、Western blot法检测细胞内Nrf2核转位情况及Nrf2、GPX4两种相关蛋白的表达情况,并通过分子对接及动力学方法模拟当归多肽MFQGF、LLGY与Keap1蛋白相互作用,分析当归多肽对Keap1-Nrf2蛋白质-蛋白质相互作用（Keap1-Nrf2 PPI）的干扰作用,进而阐释其细胞铁死亡抑制作用分子机制。借助分子对接虚拟筛选技术对20种氨基酸、400种二肽、8000种三肽与Keap1蛋白进行分子对接模拟,分析氨基酸组成及排列顺序对其与Keap1蛋白分子结合能力的影响。初步在Keap1-Nrf2 PPI角度分析抗氧化肽构效关系。结果:本文通过凯氏定氮法测得当归脱脂粉中总蛋白含量为19.28±1.02%。碱提酸沉法提取最佳工艺条件为pH值11.7,液料比50:1,提取时间20 min,酸沉pH值为4.0。蛋白质提取率可达36.03±0.31%。高效液相色谱法测定当归粗蛋白强酸完全水解后氨基酸组成含量,结果表明当归粗蛋白中氨基酸种类丰富,平衡性良好,总氨基酸含量为25.52%,其中必需氨基酸占总氨基酸含量的33.39%,符合人体对氨基酸的基本需求。此外,当归蛋白中还富含抗氧化活性相关氨基酸如Leu、Glu、Gly、Lys和Tyr等,是一种优质的抗氧化肽来源。当归多肽制备酶解最佳用酶为中性蛋白酶,优化后最佳酶解条件为:酶解时间2.6 h,酶解温度43℃,加酶量4200 U/g,液固比169:1。在此条件下制备得到的当归酶解液AsPH无论在醇溶液还是在水溶液反应体系中均表现出良好的抗氧化活性,能在低浓度下有效清除自由基及亚铁离子,并具有一定的还原能力。超滤法对AsPH进行分离后得到三个组分,即AsPH-I（＞10 kDa）,AsPH-II（3-10 kDa）和AsPH-III（＜3 kDa）,后二者抗氧化活性较强。二者合并,利用Sephadex G-25进行后续分离,得F1及F2两个组分,其中F2组分抗氧化活性显著高于F1,被认为是当归多肽的抗氧化有效组分。借助UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS技术分析,从F2中共鉴定出多肽1099种,其分子量在0.23～1.99 kDa之间,其中分子量＜0.97 kDa的多肽占总数的94.29%。分子对接及数据库生物活性预测结果提示:序列为MFQGF、FQGF、VLPQL、FLLP、FVTP、LLGY、LYN、LAY、TVTY、VTGGSYG、VVNQF、LATY、VFL、LAFLP、VLNK、LFSP、LLAN 的 17 条当归多肽,具有较好的抗氧化潜力。化学抗氧化活性验证分析表明,12条肽段MFQGF、FQGF、VLPQL、FLLP、FVTP、LLGY、LYN、LAY、TVTY、VTGGSYG、VVNQF、LATY 均具有一定的自由基清除能力,其中 LLGY、LYN、LAY、TVTY、VTGGSYG、LATY、MFQGF 七条肽段自由基清除能力较强。结合量子化学计算结果发现这七种多肽段的分子EHOMO较高,ΔE值较小,预测其电子转移能力较强,这与DPPH、ABTS自由基清除实验结果基本一致。通过Pearson相关性分析发现多肽的EHOMO、ΔE值与其自由基清除能力显著相关,EHOMO越大或ΔE值越小,其自由基清除能力越强,二者计算值可作为预测多肽化学抗氧化活性的辅助手段。为进一步探究多肽自由基清除机制,对20种游离氨基酸进行自由基清除能力评价并通过量子化学计算其BDE及ET活性位点。结果表明,8种氨基酸如Cys、Tyr、Trp、Phe、Met、His、Lys和Arg能通过HAT或ET的机制达到清除自由基的效果。其中Cys、Tyr、Trp、Phe、Met和His 6种氨基酸HAT能力较强,其HAT活性位点分别为S6-H、O10-H、C5-H、C5-H、C6-H、C5-H。除Phe外,其余7种氨基酸均具有良好的ET能力,其活性位点分别为S6、C6、C6、S7、C7、N9和N10。通过对比分析游离氨基酸与多肽活性位点,可发现抗氧化活性氨基酸残基是多肽抗氧化活性的主要来源,且多肽中ET活性位点由其序列中所含活性氨基酸残基决定,与该氨基酸游离状态下活性位点一致。在HT22细胞铁死亡模型中,化学抗氧化实验筛选得到的12条当归多肽段表现出强弱不等的抑制活性,其中MFQGF（629.27 Da）、LLGY（465.27 Da）活性最强。CCK-8结果显示,当归多肽F2组分及MFQGF、LLGY均能显著抑制由erastin诱导的HT22细胞死亡;DCFH-DA、C11-BODIPY荧光探针流式结果显示,归抗氧化肽F2组分及MFQGF、LLGY能有效地抑制细胞内ROS及LPO的积累,降低细胞内脂质过氧化程度。Nrf2特异性抑制剂ML385可削弱当归多肽对HT22细胞铁死亡的抑制作用,推测当归多肽的细胞铁死亡抑制作用可能与激活Nrf2通路有关。基于此,采用免疫荧光法及Western blot法检测细胞内Nrf2核转位情况及Nrf2、GPX4两种相关蛋白的表达情况,结果表明当归多肽能显著上调处理组细胞内Nrf2、GPX4蛋白表达量,并促进细胞中Nrf2转移入核,说明当归多肽能通过促使Nrf2入核,调控下游抗氧化保护蛋白,进而达到抑制细胞发生铁死亡的作用。通过进一步分子动力学模拟发现,MFQGF、LLGY能通过与Keap1蛋白对接结合从而干扰Keap1-Nrf2 PPI,使Keap1-Nrf2结合自由能下降,且MFQGF的干扰能力强于LLGY,与荧光免疫及Western blot实验结果吻合,说明MFQGF、LLGY激活Nrf2的分子机制与其干扰Keap1-Nrf2 PPI有关。为进一步探究抗氧化肽构效关系,利用分子对接技术对20种氨基酸与Keap1蛋白进行分子对接,实验结果表明,具有芳香结构的四种氨基酸Trp、Tyr、Phe、His对接分数较高,其中Trp对接分数最高为7.4,其余氨基酸对接分数均小于6.5;400种二肽与Keap1蛋白对接结果表明,400种二肽对接分数范围为4.75-9.5,59种二肽与Keap1蛋白对接分数大于7.1,对分数较高的二肽进行分析表明序列中含有芳香族氨基酸残基的二肽与Keap1蛋白相互作用能力较强;此外,活性氨基酸氨基的位置对二肽的对接结合能力也有一定的影响,芳香族氨基酸残基在N端更有利于二肽与Keap1蛋白对接结合,具有较高的抗氧化潜力,其对活性的贡献程度由大到小排序为Trp、Tyr、Phe、His,而疏水性氨基酸在二肽的C端更有利于其与Keap1蛋白对接结合。基于8000种三肽与Keap1蛋白对接结果分析表明,三肽序列中芳香族氨基酸的数量是影响其与Keap1蛋白对接结合最关键因素,含有两个及以上芳香族氨基酸的三肽对接能力较强。在芳香族氨基酸数量符合上述条件的情况下,当芳香族氨基酸残基处于三肽的N端或C端时对接结合能力较强。此外,Gly等疏水性氨基酸残基的存在也是其发挥高结合活性的关键因素,且疏水性氨基酸残基处于2位时,三肽分子对接分数较高,可推测具有上述结构特征的三肽其抗氧化活性较强。结论:本文以当归多肽为实验对象,系统研究其酶解、分离、纯化工艺。通过液质联用及分子对接虚拟筛选鉴定获得主要活性成分,发现归多肽提取物及其活性肽段具有良好的自由基清除活性,其作用机制与游离氨基酸相同,均可通过HAT与ET达到自由基清除的目的,且肽段的抗氧化活性主要来源于其序列中含有的活性氨基酸残基,并遵循活性位点保留原则,即肽段ET活性位点与其中含有的活性氨基酸游离状态下一致。当归多肽能通过激活Nrf2通路抑制由erastin诱导的HT22细胞铁死亡,起到神经保护作用,作用机制可能与当归多肽能干扰Keap1-Nrf2 PPI有关。基于分子对接探究抗氧化肽构效关系,发现肽段中氨基酸组成及排列顺序均能影响其对接结合能力,其中芳香族氨基酸残基是影响肽段与Keap1对接的关键因素,当肽段中含有芳香族氨基酸,且其处于肽段两端时,该肽段具有较强的抗氧化潜力。当归多肽作为良好的抗氧化剂及铁死亡抑制剂来源,为安全高效的天然抗氧化剂开发及铁死亡相关疾病的治疗提供新的选择。