PKMYT1对肺腺癌放射敏感性的影响

来源 :中国医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:linxiao13421
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目的:肺腺癌是最常见的肺癌类型之一,近几十年来其发生率显著增长。放射疗法是肺腺癌的有效治疗方法,但是,肺腺癌对放射治疗表现出不同程度的放射抵抗性,是影响放射治疗效果从而导致治疗失败的主要因素。因此,探讨提高肺腺癌放射敏感性方法和手段对肺腺癌的临床放射治疗有重要的意义。本研究采用生物信息学方法分析GEO肺腺癌芯片,从肺腺癌芯片中寻找与肺腺癌不良预后相关基因,然后从中选出可能作为调控肺腺癌放射敏感性靶点的基因进行深入实验。研究方法:1、GEO数据库中选取了三个肺腺癌的基因表达谱(GSE32863,GSE33532和GSE43458)。使用GEO2R在线工具来筛选各基因表达谱中与癌旁正常肺组织相比在肺腺癌组织中表达上调的基因,然后使用Venn在线软件筛选三个数据集中共同表达上调的基因。在DAVID在线网站中对这些基因进行基因本体论(Gene Ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genome,KEGG)分析。使用STRING在线网站来获取基因之间的蛋白质相互作用网络(protein-protein interaction network,PPI),随后使用Cytoscape软件来检查这些基因之间的潜在相关性并且使用MCODE插件来分析蛋白质相互作用网络中的重要模块来获取核心基因。使用Kaplan Meier-plotter在线网站分析核心基因对肺腺癌患者生存的影响。通过使用GEPIA在线网站来分析核心基因在肺腺癌组织和正常肺组织之间的差异表达情况。2、30对肺腺癌组织和癌旁正常肺组织均从中国医科大学附属第一医院胸外科手术切除标本获得。通过Western blot和Quantitative PCR(Q-PCR)实验分别检测PKMYT1在肺腺癌组织和癌旁正常肺组织中的表达差异。使用Kaplan-Meier网站分析PKMYT1的表达与肺腺癌患者的生存预后以及临床特征的关系。体外培养五种人肺腺癌细胞系A549、H1299、H1975、H1650和H441。使用Western blot检测这五种细胞系中PKMYT1的表达水平。选取PKMYT1表达最高的H1299和A549细胞系进行后续实验。通过质粒转染降低H1299和A549细胞中PKMYT1的表达水平。使用Western blot和Q-PCR实验来检测细胞中PKMYT1的表达情况,确定质粒沉默效率。通过克隆形成实验来检测降低PKMYT1表达对肺腺癌A549和H1299细胞放射敏感性的影响。通过检测0和4Gy剂量下降低PKMYT1的表达对细胞周期的影响来探究PKMYT1影响肿瘤细胞放射敏感性的潜在机制。结果:1、生物信息学分析结果发现14个与肺腺癌不良预后相关的重要基因(PKMYT1,TTK,CHEK1,CDC20,PTTG1,MCM2,CDC25C,MCM4,CCNB1,CDC45,MAD2L1,CCNB2,BUB1和CCNA2)(P<0.05),上述基因可能是肺腺癌的预后生物标志物和潜在的治疗靶点。我们在了解这14个基因现有的文献研究后发现PKMYT1可能与肺腺癌放射敏感性关系较大,有可能成为调控放射敏感性的潜在靶点,值得我们进一步验证和研究探讨。2、肺腺癌组织样本的Western blot和Q-PCR实验结果显示PKMYT1在腺癌组织中的蛋白和mRNA表达水平高于癌旁正常组织(P<0.05,P<0.05)。Kaplan-Meier分析结果显示PKMYT1的高表达与男性、女性、M0期、吸烟和手术切缘阴性的肺腺癌患者较差的总生存期(OS)和无进展生存期(FPS)有显著相关性(P<0.05)。根据Western blot的结果,我们选取PKMYT1表达最高的H1299和A549进行PKMYT1沉默质粒的转染。Western blot和Q-PCR结果显示转染沉默质粒的细胞PKMYT1的表达有明显的降低(P<0.05,P<0.05)。克隆形成实验结果显示降低PKMYT1表达的肿瘤细胞对射线敏感性提高(P<0.05)。细胞周期实验结果显示降低PKMYT1的表达后,A549和H1299细胞周期中G2-M期细胞的百分比较对照组减少(P<0.05),并且受照射后的G2-M期细胞比例也发生了明显的减少,消除了射线引起的G2-M阻滞(P<0.05)。结论:本研究使用生物信息学分析确定了与肺腺癌不良预后有关的14个重要基因((PKMYT1,TTK,CHEK1,CDC20,PTTG1,MCM2,CDC25C,MCM4,CCNB1,CDC45,MAD2L1,CCNB2,BUB1和CCNA2)。这14个基因可能是肺腺癌可行的预后生物标志物和潜在的治疗靶点。本研究首次证实了降低PKMYT1的表达能够提高肿瘤细胞的放射敏感性,并且其潜在机制可能是消除辐射诱导的G2-M阻滞。
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