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背景:近年来,随着人们对卫生要求的逐渐提高,各种类型的化学消毒剂开始进入人们的视野,并在人类的生产生活方面发挥着重要的作用,胍类化合物因其具有强碱性、不易挥发、杀菌性能好等优良特性,在医疗卫生、家庭生活、食品工业等方面得到越来越广泛的应用。目前,我国应用和研究较多的有氯己定、聚六亚甲基双胍、聚六亚甲基胍（polyhexamethylene guanidine,PHMG）及其衍生物。PHMG虽是一种代表性的胍类消毒剂,但关于PHMG的毒性研究多数集中在急性经口毒性试验、皮肤黏膜刺激试验等方面,国内尚无针对PHMG的呼吸毒性开展研究,缺乏相关的理论数据。目的:1、探讨小鼠吸入PHMG毒性效应的时间和剂量反应关系,并为PHMG的危险性评价提供毒理学数据;2、探讨TGF-β/Smad信号通路在吸入PHMG致小鼠肺组织纤维化损伤中的作用。方法:1、50只5-7周龄C57BL/6N小鼠按体重随机分为对照组（纯水）、对照时间延长效应组（纯水）、低剂量组（1.03 mg/m3）、低剂量时间延长效应组（1.03 mg/m3）和高剂量组（9.09 mg/m3）,每组雌雄各半。利用雾化器将PHMG气溶胶吹入各染毒柜中,低剂量组和高剂量组每天染毒4h,连续21 d。染毒期间,对染毒柜中PHMG气溶胶的浓度进行测量。低剂量时间延长效应组每天染毒4 h,连续21 d后,停止染毒,使小鼠继续呼吸正常空气21 d,每隔一天称量小鼠体重以检测体重的变化情况。末次染毒结束后24 h,称量小鼠末次体重;对小鼠进行支气管肺泡灌洗,灌洗液离心,上清-80℃冻存备用,细胞沉淀经过PBS重悬、涂片、染色,镜下对灌洗液进行细胞总计数和4类炎性细胞分类计数（包括巨噬细胞数、淋巴细胞数、中性粒细胞数和嗜酸性粒细胞数）;解剖收集肝、心、脾、肺、肾等脏器,称重后计算各脏器系数,并对肺脏进行组织病理学检查,Masson染色观察纤维化改变。2、支气管肺泡灌洗后,酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA）测定肺灌洗液上清中转化生长因子β1（Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1）的含量;解冻小鼠肺组织,液氮研磨成粉末,Trizol法提取小鼠肺组织总mRNA,实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR）检测小鼠肺组织中I型胶原COL1A1（Collagen,type I,alpha 1）和纤连蛋白FN（Fibronectin）等纤维相关因子的表达水平;分别采用免疫组织化学（Immunohistochemical,IHC）染色和免疫荧光（Immunofluorescence,IF）染色检测小鼠肺组织中平滑肌肌动蛋白α-SMA（Alpha smooth muscle actin）和TGF-β1的表达水平;免疫印迹法检测小鼠肺组织中Fibronectin、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、Smad4 和 TGF-β1 的表达水平变化情况。结果:1、连续吸入PHMG3周后,小鼠体重和肺部病理改变出现明显的剂量反应,即随着暴露剂量的增加,小鼠的各种不良反应逐渐加重:连续染毒21 d后,低剂量组PHMG气溶胶浓度约为1.03 mg/m3,高剂量组浓度约为9.09 mg/m3。染毒期间高剂量组小鼠体重显著降低,而低剂量组小鼠体重仍呈现增长趋势,但增长趋势减慢,末次体重低于对照组。高剂量组小鼠肺脏系数显著高于低剂量组和对照组（P<0.01）,肾脏系数和心脏系数显著降低（P<0.05）。高剂量组肺泡灌洗液中总细胞数和4类炎性细胞数显著高于对照组（P<0.05）;但低剂量组的总细胞数显著降低（P<0.01）。各剂量组小鼠均可见肺组织纤毛被破坏、肺泡壁结构紊乱、肺间隔增厚、可见充血、气道上皮细胞脱落等病理改变,高剂量组更加严重,可见实质化改变;低、高剂量小鼠肺组织损伤病理评分分别为4.47±0.33和4.83±0.16,明显高于对照组1.58±0.09;Masson染色观察到各剂量组小鼠肺组织出现胶原沉积,并且高剂量组胶原沉积更加明显。免疫组织化学结果显示,各剂量组小鼠肺脏α-SMA蛋白阳性表达区域增加,这说明该蛋白的表达水平升高,高剂量组阳性表达细胞数目更多;酶联免疫吸附实验结果表明,低、高剂量组小鼠肺灌洗液上清中TGF-β1的含量明显升高,免疫荧光结果也显示TGF-β1表达阳性区域明显增加;小鼠吸入PHMG气溶胶21 d后,高剂量组小鼠肺组织COL1A1和FNmRNA的表达水平显著高于对照组（P<0.05）。染毒组本底的Smad2和Smad3的水平降低,而高剂量组的Smad4,p-Smad3,p-Smad3/Smad3,p-Smad2,p-Smad2/Smad2,TGF-β1 和 Fibronectin 的蛋白表达水平显著增加,低剂量组各蛋白的表达水平也呈上升趋势,说明TGF-β/Smad信号通路在PHMG诱导的肺纤维化过程中被激活,且反应具有剂量-反应关系。2、连续吸入PHMG3周,又继续给与正常空气3周后,小鼠体重和肺部病理改变出现明显的时间反应,即停止吸入PHMG后,其所造成的不良影响仍在继续发展恶化:低剂量时间延长效应组PHMG气溶胶浓度约为1.03 mg/m3,连续染毒21 d结束后的延长效应期,低剂量时间延长效应组小鼠体重仍呈现增长趋势,但增长趋势减慢,末次体重低于对照时间延长效应组,高于低剂量组。低剂量时间延长效应组小鼠肺脏系数显著高于低剂量组（P<0.01）,心脏系数显著低于低剂量组和对照时间延长效应组（P<0.05）。低剂量时间延长效应组肺泡灌洗液中总细胞数显著低于对照时间延长效应组,但与低剂量组相比明显升高。两染毒组小鼠均可见肺组织纤毛缩短、肺泡壁增厚、气道上皮细胞脱落等病理改变,低剂量时间延长效应组更加严重;低剂量时间延长效应组小鼠肺组织损伤病理评分为5.08±0.12,明显高于低剂量组4.47±0.33和对照时间延长效应组1.57±0.08;低剂量时间延长效应组小鼠肺组织出现大范围胶原沉积,周围可见明显地实质化改变。免疫组织化学结果显示,低剂量时间延长效应组α-SMA蛋白表达水平升高,显著高于低剂量组和对照延长效应组;酶联免疫吸附实验和免疫荧光结果均显示TGF-β1的水平显著升高;小鼠吸入PHMG气溶胶21 d,继续吸入正常空气21 d后,低剂量时间延长效应组小鼠肺组织COL1A1和FN mRNA的表达水平明显高于对照组。低剂量时间延长效应组的p-Smad2,p-Smad3,Smad4,p-Smad2/Smad2浓度以及Fibronectin的蛋白表达水平显著高于低剂量组,说明即使停止暴露,TGF-β/Smad信号通路仍处于活化状态,使PHMG诱导的肺纤维化呈现出一定的持续性和不可逆性。结论:1、21 d连续吸入染毒PHMG气溶胶主要引发肺组织纤维化改变,并且这种改变存在明显的剂量-反应和时间-反应关系,即随着染毒剂量的增加和时间的延长,肺部纤维化改变更加明显,即使是在停止染毒之后,这种不良反应仍会继续发展,说明吸入PHMG引起的肺纤维化具有持续性和不可逆性。本研究也为后续开展PHMG肺纤维化毒性研究,探索肺纤维化发病机制和治疗手段提供了较为理想的动物模型和可靠的分析手段。2、长期吸入PHMG气溶胶可引起小鼠肺组织纤维化改变,TGF-β/Smad信号通路参与PHMG诱导肺部纤维化的病理过程。靶向TGF-β/Smad信号通路相关药物的开发可能对PHMG吸入诱导的肺纤维化治疗有效。