非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）是指除酒精外,由多种病因引起的弥漫性肝实质细胞脂肪变性,以甘油三酯（triglyceride,TG）脂质蓄积为主要特征的临床病理综合征。NAFLD的危险因素较多,常与代谢综合征（metabolic syndrome,MS）的肥胖、糖脂代谢紊乱并存,因此NAFLD是MS的肝脏表现。流行病学调查显示,NAFLD发病率居高不下并有低龄化趋势,因此对NAFLD的研究已成为当务之急。传统观点认为,NAFLD主要与出生后的生活环境有关,但近年越多越多的研究证实,脂肪肝等代谢性疾病的发生可追溯到宫内时期。研究表明,孕期不良宫内环境会导致子代发育毒性,如宫内发育迟缓（intrauterine growth retardation,IUGR）。IUGR不仅能够造成多种妊娠不良结局,其远期危害还将延续至出生后,表现为MS易感性增加。本室前期研究发现,孕期咖啡因暴露（prenatal caffeine exposure,PCE）作为一种独立危险因素,可致IUGR子代高脂饮食下成年NAFLD发生。然而,迄今为止,PCE所致IUGR成年子代NAFLD易感的诱因及相关分子机制尚未完全阐明。研究表明,宫内时期肝脏脂质代谢异常所致的TG蓄积可能是成年NAFLD易感的重要原因之一。其中肝脏脂肪酸从头合成（de novo lipogenesis,DNL）在NAFLD的发生发展中发挥着重要作用。肝脏固醇调节元件结合蛋白1c（sterol regulatory element binding protein 1c,SREBP1c）是最为重要的调控DNL的转录因子,活化的SREBP1c移位入核激活脂质合成酶基因表达。此外,脂解、氧化和输出酶也参与了NAFLD的发生。提示,胎源性NAFLD的发生机制与脂质代谢紊乱相关。咖啡因作为一种黄嘌呤类生物碱,广泛存在于咖啡、茶、软饮料和某些镇痛药中。研究证实,PCE导致IUGR胎儿过暴露于母源性糖皮质激素（glucocorticoid,GC）,进而导致下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitary-drenal,HPA）轴功能发育抑制和糖脂代谢功能改变,这种神经内分泌代谢编程改变在出生后表现为HPA轴低基础活性和高应激敏感性,子代成年后MS易感性。此外,考虑到咖啡因具有高脂溶性,易透过胎盘屏障进入胎儿体内,由于其代谢不良、排泄缓慢,咖啡因在胎儿体内的积累会造成直接损害。鉴于上述,PCE导致胎儿过暴露于母源性GC是否介导子代出生后的NAFLD易感,其发生机制是什么?咖啡因是否在PCE所致的NAFLD易感中发挥作用?这些都将是我们在本研究中需要解决的问题。本研究拟在前期发现的PCE所致IUGR成年雌性大鼠高脂饮食下NAFLD发生的基础上,进一步阐明PCE所致成年子代大鼠NAFLD易感的宫内编程机制。为解决上述问题,本课题拟在整体和细胞水平进行如下研究:首先在整体水平证实PCE所致28周成年子代TG蓄积和NAFLD易感现象,并结合胎鼠相关检测证实其宫内编程机制。进一步,部分子代大鼠在出生后10周开始给予为期两周的冰水游泳慢性应激来模拟宫内高GC环境,以探讨PCE子代GC依赖的肝脏TG代谢宫内编程机制。然后,在人胎肝LO2细胞上,探讨皮质醇和咖啡因对TG代谢功能的直接影响。基于我们的课题研究,可以进一步了解咖啡因的发育毒性,证实GC依赖性编程机制和咖啡因的直接作用对TG代谢影响,为进一步探讨胎源性NAFLD的早期诊断和预防提供理论和实验依据。第一部分孕期咖啡因暴露致成年子代大鼠非酒精性脂肪肝易感及脂质代谢改变目的:本部分研究拟利用PCE所致IUGR大鼠模型,通过测定28周子代血和肝脏脂质代谢指标、肝脏组织病理学变化等,探讨PCE是否导致28周子代大鼠NAFLD易感性增加的现象及可能的脂质代谢机制。方法:孕鼠分成四组:对照组和咖啡因低剂量组[PCE（L）,30 mg/kg.d],中剂量组[PCE（M）,60 mg/kg.d]或高剂量组[PCE（H）,120 mg/kg.d]。从妊娠（gestational day,GD）9到GD20,孕鼠灌胃给予不同剂量的咖啡因（30、60、120mg/kg.d）,对照组给予相同体积的生理盐水。部分对照组和PCE（H）组孕鼠喂养至自然生产,出生后（postnatal week,PW）4,子代大鼠断奶、雌雄分笼,经正常饮食喂养至PW28,记录大鼠性别、编号和体重,异氟醚麻醉后断头处死。使用生化试剂盒测定血TG、天冬氨酸转氨酶（aspartate transaminase,AST）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）、谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase,GST）以及肝脏TG水平;苏木精-伊红（H&E）和油红O染色技术观察肝脏组织病理学变化,并利用200倍H&E染色图片进行肝脏Kleiner评分;酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）技术测定血皮质酮（corticosterone,CORT）水平;实时定量PCR技术（RT-q PCR）测定肝脏m RNA表达,包括:糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor,GR）、CCATT增强子结合蛋白α（CCATT/enhancer binding proteinα,C/EBPα）、沉默信息调节因子1（silent information regulator 1,SIRT1）、固醇调节元件结合蛋白1c（sterol regulatory element binding protein 1c,SREBP1c）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase,FASN）、乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-Co A carboxylase,ACC）、ATP柠檬酸裂解酶（ATP citrate lyase,ACL）、脂肪甘油三酯水解酶（adipose triglyceride lipase,ATGL）、激素敏感性脂肪酶（hormone-sensitive lipase,HSL）、过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferator-activated receptorα,PPARα）、肉毒碱棕榈酰转移酶1α（carnitine palmitoyl transferase 1α,CPT1α）、微粒体甘油三酯转运蛋白（microsomal triglyceride transfer protein,MTTP）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα,TNFα）、白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）;Western blot技术测定肝脏蛋白表达,包括:GR、C/EBPα、SIRT1、SREBP1c、FASN。结果:与相应对照组比,（1）体重:PCE组雌性大鼠体重降低（P<0.01）,而雄性大鼠体重与对照组无明显差异;（2）血TG、ALT、AST、GST水平:PCE组雌、雄大鼠血TG水平降低,而血ALT和GST水平有增加或增加趋势（P=0.07,P<0.05,P<0.01）;（3）H&E染色和Kleiner评分:PCE组雌、雄大鼠肝索排列紊乱,细胞内外均可见大小不一的脂滴及炎性细胞灶性浸润,且Kleiner评分升高（P<0.01）;（4）油红O染色:PCE组雌、雄大鼠肝细胞内发生异常脂质积聚;（5）血CORT水平、肝脏GR-C/EBPα-SIRT1通路:PCE组雌、雄大鼠血CORT水平增加,肝脏SIRT1表达有降低或降低趋势（P=0.06,P<0.05,P<0.01）。此外,雌性子代肝脏GR和C/EBPa表达有增加或增加趋势（P=0.07,P<0.05）;（6）肝脏TG水平、TG代谢和炎症相关基因的表达:PCE组雌、雄大鼠肝脏TG水平、TG合成相关酶[雌性（FASN、ACL）、雄性（ACC）]及其转录因子SREBP1c、炎症相关基因（TNFα、IL-1β、IL-6）表达显著增加（P<0.05,P<0.01）,而氧化相关基因（PPARα、CPT1α）表达降低（P<0.01）。此外,MTTP基因表达在雄性显著降低（P<0.01）。结论:PCE 28周龄雌、雄大鼠异常肝脏脂质蓄积并伴随肝损伤,这可能与肝脏脂质合成和炎症相关指标增加以及脂质氧化减少相关。此外,降低的脂质输出也参与PCE 28周龄雄性大鼠肝脏脂质蓄积。第二部分孕期咖啡因暴露致子代大鼠非酒精性脂肪肝易感的宫内起源及脂质代谢编程机制目的:本部分研究拟利用PCE所致IUGR大鼠模型,通过测定胎鼠体重、IUGR率、血和肝脏脂质代谢指标、肝脏组织病理学变化,探讨PCE所致子代大鼠肝脏脂质蓄积的宫内起源及编程机制。方法:PCE模型建立同第一部分,在GD20,孕鼠用异氟醚麻醉处死。记录胎鼠性别、编号和体重后断头处死,收集胎血和胎肝标本用于后续分析。使用生化试剂盒测定血和肝脏TG水平;H&E染色和透射电镜技术观察胎肝组织病理学变化;ELISA技术测定血CORT水平;RT-q PCR测定肝脏m RNA表达,包括:GR、C/EBPα、SIRT1、SREBP1c、FASN、ACC、ACL、ATGL、HSL、PPARα、CPT1α、MTTP;Western blot技术测定肝脏蛋白表达,包括:GR、C/EBPα、SIRT1、SREBP1c、FASN;染色质免疫共沉淀（chromatinimmunoprecipitation,Ch IP）技术测定SREBP1c、FASN启动子区组蛋白3赖氨酸14乙酰化（histone 3 lysine 14 acetylation,H3K14ac）和组蛋白3赖氨酸27乙酰化（histone 3lysine 27 acetylation,H3K27ac）水平。结果:与相应对照相比,（1）体重和IUGR率:PCE组雌、雄胎鼠体重降低而IUGR率增加,尤以PCE（M）和PCE（H）组更为显著（P<0.01）;（2）血和肝脏TG水平:PCE组雌、雄胎鼠血TG水平降低,而肝脏TG含量增加（P<0.01,P<0.05）;（3）H&E染色:PCE组雌、雄胎鼠肝细胞排列紊乱,肝索结构不清,肝窦扩张;造血干细胞明显增生,且多核巨细胞数量增多;（4）电镜结果:PCE组雌、雄胎鼠肝细胞膜及核膜结构尚完整,但异染色质边集、线粒体嵴内间隙肿胀、线粒体嵴减少且结构模糊紊乱;内质网结构支离破碎,散乱分布于多个区域;（5）胎血CORT水平、胎肝GR-C/EBPα-SIRT1通路及TG代谢相关基因的表达:PCE组雌、雄胎鼠血CORT水平增加,胎肝GR-C/EBPα-SIRT1通路激活、TG合成（SREBP1c、FASN）增加、氧化（PPARα、CPT1α）降低（P<0.01,P<0.05）。此外,胎肝脂解（ATGL、HSL）和输出（MTTP）基因表达在雄性显著降低（P<0.01）;（6）组蛋白乙酰化:PCE组雌、雄胎鼠肝脏SREBP1c和FASN基因启动子区H3K14ac和H3K27ac水平增加（P<0.01,P<0.05）。结论:PCE诱导IUGR胎鼠肝脏组织和细胞超微结构损害以及肝脏脂质蓄积,其发生机制主要与胎鼠过暴露于母源性GC,胎肝GR-C/EBPα-SIRT1通路激活,SREBP1c、FASN表达及其启动子区H3K14ac、H3K27ac水平增加,胎肝氧化降低相关。此外,肝脏TG脂解和输出功能的降低也参与PCE雄性胎肝脂质蓄积。第三部分孕期咖啡因暴露子代大鼠呈现糖皮质激素依赖的脂质代谢编程机制目的:为确证GC通过影响PCE子代大鼠肝脏GR-C/EBPα-SIRT1通路,从而介导肝脏TG代谢酶宫内编程改变,我们对部分10周子代大鼠进行为期两周的冰水游泳试验,以模拟宫内环境中母血高GC水平,并测定了冰水游泳试验前、后大鼠血和肝脏TG水平、血CORT水平、肝脏GR-C/EBPα-SIRT1通路和TG代谢相关基因表达。方法:PCE模型建立同第一部分,部分对照组和PCE（H）组孕鼠喂养至自然生产。PW4时,子代大鼠断奶、雌雄分笼,经正常饮食喂养至PW10时分为4个组（对照组/PCE无慢性应激组,对照组/PCE慢性应激组）,对照组/PCE慢性应激组接受为期两周的冰水游泳测试（5-7°C,5 min/d）。PW12经历最后一次冰水游泳1 h后,记录四组大鼠性别、编号和体重,异氟醚麻醉后断头处死。使用生化试剂盒测定血和肝脏TG水平;ELISA技术测定血CORT水平;RT-q PCR测定肝脏m RNA表达,包括:GR、C/EBPα、SIRT1、SREBP1c、FASN、ACC、ACL、ATGL、HSL、PPARα、CPT1α、MTTP;Western blot技术测定肝脏蛋白表达,包括:GR、C/EBPα、SIRT1、SREBP1c、FASN;Ch IP技术测定SREBP1c、FASN启动子区H3K14ac和H3K27ac水平。结果:（1）慢性应激前、后大鼠血CORT水平、肝脏GR-C/EBPα-SIRT1通路:无慢性应激下,与对照组相比,PCE组雌性大鼠血CORT水平、肝脏GR表达降低,而肝脏SIRT1表达增加（P<0.05,P<0.01）,PCE组雄性大鼠肝脏SIRT1表达增加（P<0.01）。值得注意的是,慢性应激下对照组雌、雄大鼠血CORT水平有升高趋势（P=0.06,P=0.07）。此外,与相应的无慢性应激PCE组或慢性应激下对照组相比,血CORT水平和GR、C/EBPα的基因表达显著增加,但SIRT1的基因表达降低（P<0.05,P<0.01）;（2）慢性应激前、后大鼠血/肝脏TG水平:在应激状态下,PCE组雌性大鼠血TG水平较对照组略有下降（P=0.06）。此外,与相应的无慢性应激PCE组或慢性应激对照组相比,PCE组雌、雄大鼠肝脏TG水平显著增加（P<0.05,P<0.01）;（3）慢性应激前、后大鼠肝脏TG代谢酶表达:无慢性应激时,与对照组相比,PCE组雌、雄大鼠肝脏脂质合成酶（FASN、ACL、ACC）及其转录因SREBP1c呈低表达（P<0.05,P<0.01）,其中脂解（ATGL、HSL）表达仅在雄性大鼠肝脏降低（P<0.05）。与相应的无慢性应激PCE组或慢性应激对照组相比,PCE组肝脏SREBP1c、FASN和/或ACC、ACL表达显著增加,但ATGL基因表达仅在雌性大鼠显著降低（P<0.05,P<0.01）;（4）慢性应激前、后大鼠肝脏SREBP1c和FASN启动子区组蛋白乙酰化:与对照组相比,基础状态下PCE雌、雄性大鼠组肝脏SREBP1c和FASN启动子区H3K14ac和H3K27ac水平降低,慢性应激可逆转上述表达（P<0.05,P<0.01）。结论:慢性应激后高血GC水平重现了宫内母源性高GC介导的PCE子代大鼠肝脏GR-C/EBPa-SIRT1信号通路激活和TG合成功能增加,SREBP1c和FASN的表观遗传调控机制参与其中。第四部分咖啡因和皮质醇暴露对人胎肝细胞系脂质代谢的直接作用目的:采用皮质醇和咖啡因处理LO2细胞系,以证实GC和咖啡因对肝脏TG代谢的直接影响。通过GR或C/EBPαsi RNA、激活SIRT1证实GR-C/EBPα-SIRT1通路参与皮质醇所致肝细胞TG合成酶表达及组蛋白乙酰化水平改变。通过激活腺苷A2A受体（adenosine A2A receptor,A2AR）、环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,c AMP）及SIRT1证实A2AR-c AMP-PKA-SIRT1通路抑制参与咖啡因所致肝细胞TG代谢酶表达改变。方法:1)胎血咖啡因浓度:采用气相色谱和质谱联用技术,检测PCE（L）组雌、雄胎血咖啡因浓度。2)皮质醇处理细胞:（1）在人胎肝LO2细胞系上,采用不同浓度皮质醇（0、300、600、1200 n M）处理LO2细胞24 h,MTS法用于测定细胞毒性。组织细胞甘油三酯测定试剂盒测定肝脏TG水平;RT-q PCR测定肝脏m RNA表达,包括:GR、C/EBPα、SIRT1、SREBP1c、FASN、ACC、ACL、ATGL、HSL、PPARα、CPT1α、MTTP。（2）为证实GR-C/EBPα-SIRT1通路参与皮质醇介导的胎肝细胞TG合成酶表达及组蛋白乙酰化水平改变,采用GR/C/EBPαsi RNA技术或SIRT1激动剂白藜芦醇,同时采用1200 n M皮质醇处理LO2细胞24 h用于基因表达分析。利用RT-q PCR技术测定细胞GR-C/EBPα-SIRT1和脂质代谢相关基因（SREBP1c、FASN）基因表达;Ch IP技术测定SREBP1c、FASN启动子区H3K14ac和H3K27ac水平。3)咖啡因处理细胞:（1）在人胎肝LO2细胞系上,采用不同浓度咖啡因（0、0.1、1、10、100μM）处理LO2细胞24 h,MTS法用于测定细胞毒性。使用ELISA技术测定肝细胞c AMP含量;Western blot技术测定肝细胞PKA蛋白表达;RT-q PCR测定肝脏m RNA表达,包括:A2AR、SIRT1、SREBP1c、FASN、ACC、ACL、ATGL、HSL、PPARα、CPT1α、MTTP;（2）为证实A2AR-c AMP-PKA-SIRT1通路参与咖啡因介导的胎肝细胞TG代谢酶表达改变,采用A2AR/c AMP/SIRT1激动剂,同时采用100μM咖啡因处理LO2细胞24 h。利用RT-q PCR技术测定SIRT1基因表达。结果:1)胎血咖啡因浓度:PCE（L）组雌、雄胎血中咖啡因浓度分别为72±6μM和84±7μM。2)皮质醇处理细胞:（1）不同浓度皮质醇对脂质代谢的影响:MTS结果显示不同浓度皮质醇对细胞活力无明显影响。给与不同浓度皮质醇处理LO2细胞24 h,肝细胞TG含量、GR和C/EBPα表达增加,而SIRT1表达降低（P<0.05,P<0.01）。同时,SREBP1c及脂质合成酶FASN、ACL、ACC表达增加,脂解（ATGL、HSL）及氧化CPT1α表达降低或有降低趋势,以1200 n M皮质醇处理组变化更显著（P<0.05,P<0.01,P=0.07或0.08）;（2）GR/C/EBPαsi RNA对皮质醇处理下SIRT1、脂质合成基因表达及表遗传的影响:GR si RNA逆转皮质醇对SIRT1 m RNA表达的抑制作用（P<0.05,P<0.01）。GR和C/EBPαsi RNA能逆转皮质醇促SREBP1c和FASN表达和组蛋白乙酰化位点H3K14ac和/或H3K27ac水平增加的作用（P<0.05,P<0.01）;（3）白藜芦醇对皮质醇处理下SIRT1、脂质合成基因表达及表遗传的影响:白藜芦醇可逆转皮质醇对SIRT1 m RNA表达的抑制作用（P<0.01）,以及SREBP1c和FASN基因表达及其启动子区H3K14ac、H3K27ac水平增加的作用（P<0.05,P<0.01）。3)咖啡因处理细胞:（1）不同浓度咖啡因对脂质代谢的影响:MTS结果显示不同浓度咖啡因对细胞活力无明显影响。给予不同浓度咖啡因处理LO2细胞24 h,咖啡因处理组A2AR和SIRT1的m RNA表达减少,c AMP含量降低,PKA蛋白表达抑制,且呈浓度依赖性（P<0.05,P<0.01）。同时,我们发现TG合成（SREBP1c、FASN、ACL、ACC）、脂解（ATGL、HSL）、氧化（CPT1α、PPARα）基因表达增加或有增加趋势（P<0.05,P<0.01,P=0.06或0.07）,而MTTP基因表达降低（P<0.05,P<0.01）,尤其是在10和100μM咖啡因处理组;（2）c AMP/A2AR/SIRT1激动剂对咖啡因处理下SIRT1表达的影响:与0μM咖啡因处理组相比,100μM咖啡因处理组SIRT1基因表达水平下降（P<0.01）,而c AMP激动剂（CGS-21680）、A2AR激动剂（forskolin）或白藜芦醇处理24 h可逆转咖啡因对SIRT1基因表达的抑制作用（P<0.05,P<0.01）。结论:在LO2细胞水平,皮质醇通过增加TG合成、抑制脂解和氧化从而增加脂质蓄积,GR-C/EBPα-SIRT1通路参与皮质醇促SREBP1c、FASN表达及其启动子区组蛋白乙酰化水平作用。咖啡因可直接抑制A2AR-c AMP-PKA-SIRT1信号通路,通过增加TG合成、脂解、氧化,抑制输出从而影响脂质代谢。结果显示皮质醇和咖啡因通过不同的信号通路参与脂质蓄积,其中皮质醇介导的脂质合成作用占据主导地位。