研究背景I型糖尿病是威胁人类健康的一个重要的自身免疫疾病，由于其发病人群主要是在青少年，因此该疾病具有严重的危害性。I型糖尿病最基本的病理过程是：机体因多种原因造成免疫系统失去了对自身胰岛β细胞多种抗原的耐受，从而导致胰岛β细胞被自身活化的T细胞破坏，引起糖尿病。因此从理论上说，如果能有效地抑制自身反应性T细胞（auto-reactive T cells）活化，恢复T细胞对胰岛β细胞抗原的耐受，是治愈该疾病最理想的方法。非肥胖性糖尿病（non-obese diabetic，NOD）小鼠是一种自身免疫疾病的模型动物，其自发糖尿病的病理过程和人类I型糖尿病(type1diabetes，T1D)的病理过程极为相似，因此目前对于I型糖尿病的诸多理论上的认识，均来自于对NOD小鼠的研究结果[135]。近年来的研究表明程序性死亡[蛋白]1（programmed death-1，PD-1）分子是一个维持机体免疫耐受的重要受体分子，PD-1分子的功能缺失，将直接破坏机体对自身抗原的耐受，导致免疫疾病的发生[105]。Ansari和课题组成员的研究结果表明程序性死亡[蛋白]配体1（programmed death ligand1，PDL1）与PD-1结合后的信号通路在I型糖尿病的发病过程中至关重要。PDL1/PD-1通路不仅参与机体免疫耐受的启动并在维持机体免疫耐受中也发挥重要作用。在对NOD小鼠的研究中发现，作为NOD小鼠中主要的抗原递呈细胞之一的B细胞，其表面并不表达PDL1，因此在NOD小鼠中，B细胞并不能通过PDL1/PD-1通路来抑制自身反应性T细胞，尤其是CD4+T细胞的活性。因此本课题在以往研究的基础上，试图通过建立PDL1转基因小鼠的办法，让B细胞稳定表达PDL1，从而建立稳定的PDL1/PD-1抑制通路，以期延缓或降低糖尿病的发生，为人类I型糖尿病的治疗提供理论和方法上的探索。目的1．拟采用PDL1转基因的方法，建立NOD背景的TgPDL1-NOD小鼠促，使NOD小鼠B细胞表面表达PD-L1分子，建立稳定的PD-L1/PD-1通路；2．通过B细胞-T细胞的相互作用，抑制NOD小鼠体内的自身反应性T细胞，尤其是CD4+T细胞的活性，以阻止或延缓NOD小鼠糖尿病的发生。方法1.克隆PDL1基因的cDNA，并将PDL1片段插入到真核表达载体pCAGGS载体中，构建转基因载体pCAG-PDL1，转基因载体线性化后通过原核显微注射的方法，建立C57BL/6背景的转基因小鼠TgPDL1-B6；通过交配策略建立TgPDL1-NOD（在NOD遗传背景下的pdl1转基因小鼠）并鉴定PDL1的表达情况。2.通过流式检测对B细胞原有生物学特性进行鉴定：比较转基因小鼠和野生型小鼠B细胞表面分子IgM、 MHCⅡ、CD80、CD86等的表达情况。分析比较转基因小鼠和野生型小鼠脾脏、胸腺、胰腺淋巴结中CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例。通过HE染色比较不同周龄、和雄性转基因小鼠和野生型小鼠胰岛炎情况。3.体外观察Bpdl1细胞和野生型B细胞对NOD小鼠中CD4+T细胞的增殖和活化影响；过继性转移野生型小鼠的T细胞，分别混合TgPDL1-NOD小鼠BPDL1和野生型NOD小鼠B细胞到NOD-scid（全称为NOD/LtSzPrkdcscid/J，为T、B、NK细胞缺陷的严重联合免疫缺陷动物模型）小鼠体内，观察移植后NOD.SCID小鼠的糖尿病发病率，以明确B细胞的作用。结果1.通过分子克隆技术，成功获得PDL1基因的cDNA，构建转基因载体pCAG-PDL1；后通过原核显微注射等方法建立TgPDL1-B6转基因小鼠，得到3只首建鼠，通过与野生型小鼠交配维持转基因品系的稳定系；最后通过交配策略成功建立了NOD遗传背景下的PDL1转基因小鼠—TgPDL1-NOD小鼠，2.同野生型NOD小鼠比较，TgPDL1-NOD小鼠的B细胞表面能够高表达PD-L1，并且PD-L1的高表达并没有影响B细胞表面其他分子的表达以及B细胞分泌抗体的能力，B细胞的原有生物学特性没有因转基因而受到影响；此外，流式检测结果显示，PD-L1的高表达对脾脏、胸腺、胰腺淋巴结淋巴细胞中CD4+T细胞、CD8+T细胞的比例没有影响。3.组织学观察比较了8周、12周、16周、20周、28周的TgPDL1-NOD小鼠和NOD小鼠的胰岛炎情况，结果显示无论是雌鼠还是雄鼠，同野生型小鼠相比，转基因小鼠的胰岛被破坏程度和胰岛炎严重程度都明显减弱。4.体外淋巴细胞混合培养实验检测上清中分泌的IL-2、IFN-γ水平以及CFSE标记的T淋巴细胞增殖实验结果显示BPDL1细胞能够一定程度上抑制CD4+T细胞的增殖。结论1.通过原核显微注射等方法建立TgPDL1-B6转基因小鼠，PDL1在多种组织中高表达，包括T、B淋巴细胞。PDL1转基因以半合子的形式稳定遗传。2.通过交配策略成功建立了NOD遗传背景下的PDL1转基因小鼠—TgPDL1-NOD小鼠。在NOD背景的小鼠中，PD-L1的高表达没有影响B细胞的一些基本特性（表面重要标志分子的表达和分泌抗体的能力）以及淋巴细胞数量和比例。NOD小鼠中高表达PD-L1后，可以抑制自身反应性T细胞对胰岛的浸润，减弱胰岛炎的发生。3.进一步研究发现BPDL1细胞已被证实能在体外培养条件下抑制CD4+T细胞增殖和细胞因子的分泌。初步的过继转移实验表明当B、T细胞比例为1:1时，BPDL1细胞无法阻止自身反应性T细胞对胰岛的浸润，延缓糖尿病发病，实验正在重新进行。4. NOD小鼠除了易自发I型糖尿病外，还有易感其它自身免疫疾病的倾向，PD-L1/PD-1信号通路已被证实在启动和维持机体的免疫耐受中起着重要的作用，因此，我们所建立的TgPDL1-NOD小鼠还可用于其他自身免疫疾病的研究，是一个很好的动物模型。