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就血液系统肿瘤而言，无论是强烈化疗还是自体造血干细胞移植，都难以完全清除微小残存的白血病细胞即微小残留病灶(minimalresidualdisease，MRD)，因而导致疾病复发。人们在应用异基因造血干细胞移植(allo-stemcelltransplantation，allo-SCT)治疗白血病过程中发现了移植物抗白血病(graft-versus-leukemia，GVL)效应，并认为此作用能有效地清除MRD，预防白血病复发，延长缓解期。因此人们正在尝试对白血病进行特异性免疫治疗，达到诱导GVL效应、有效清除体内MRD的目的，其中的有效策略之一就是诱导并回输白血病特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)。
白血病细胞逃逸免疫监控的机制主要与共刺激分子和黏附分子缺乏或表达低以及分泌抑制免疫应答的细胞因子等有关，白血病细胞抗原不能被有效提呈，以至于宿主T细胞不能识别和清除。因而如何将白血病抗原有效的提呈并激活T细胞免疫应答是特异性免疫治疗的关键。
树突状细胞(dendriticcells，DCs)是免疫系统功能最强的专职性抗原递呈细胞(antigenpresentingcells，APCs)，而且是唯一能在体外和体内激活初始T淋巴细胞的APCs。基于此人们在多个领域展开了以DCs为基础的免疫治疗研究，DCs疫苗在治疗白血病及黑色素瘤、淋巴瘤、骨髓瘤等方面取得了一些疗效。
脐带血(cordblood，CB)富含造血干细胞，主要用于造血干细胞移植(hemopoieticstemcelltransplantation，HSCT)，脐血T细胞主要是初始型Th0细胞(CD45RA+)，对异体抗原的反应弱，但经适当的刺激活化后能产生与成人外周血相当的免疫应答，而且脐血DCs产率高、诱导特异性CTLs的抗肿瘤效应强，同时不影响造血干细胞的数量。本课题的前期研究已证实脐血淋巴细胞诱导后能产生特异性的CTLs，本实验的目的是在体外实验中进一步证实：
①脐血能否在体外诱导生成CD8+CTLs?
②CD8+CTLs能否特异性杀伤白血病细胞?
③CD8+CTL与CD8-CTLs对白血病细胞杀伤率有何不同?
第一部分：体外诱导脐血单个核细胞成为树突状细胞
实验方法：(1)诱导贴壁细胞成为DCs：用贴壁法将脐血MNCs分为贴壁细胞和非贴壁细胞，前者加GM-CSF和IL-4，用于诱导DCs。隔天加入细胞因子一次，第6天加TNF-α和PGE2，第7天收集悬浮生长的DCs(2)制备U937冻融抗原；(3)抗原负载：在DCs培养的第4天，加入U937细胞冻融液0.5ml(相当于2.5×107个U937细胞制成的冻融液)；(4)诱导DCs成熟：第6天增加细胞因子TNF-α和PGE2，促进DC成熟。
结果：(1)脐血MNCs的形态学变化：刚分离出的贴壁细胞体积较小、圆形、胞体透明，散在分布。培养3天后，大部分细胞表面出现不规则的突起，长短不一，细胞体积增大，颗粒增多，数量增多，呈集落状生长，为贴壁或半贴壁。随着培养时间的延长，DCs的体积渐增，突起变长，形态更加不规则。第6天加入促成熟因子TNT-α和PGE224小时后，绝大部分的DCs呈悬浮生长，细胞均匀分散在培养基中，具有典型的DC形态。
(2)脐血MNCs的免疫表型变化：刚分离的脐血MNCs不表达或表达低水平的CD1a、HLA-DR、CD86、和CD83，表达率分别为：(13.10±8.61)％、(17.78±9.27)％、(6.18±3.60)％、(4.60±3.32)％。经联合细胞因子培养后形成的成熟DCs高度表达MHC-Ⅱ类分子和黏附因子。CD1a、HLA-DR、CD86、CD83的表达率分别为：(87.85±13.37)％、(88.74±10.67)％、(84.53±11.92)％、(48.83±21.68)％，均较培养前显著升高(P＜0.05)。
第二部分：脐血DCs介导的CD8+CTLs杀伤活性研究
实验方法：(1)贴壁法分离淋巴细胞：新鲜分离的脐血单个核细胞经2小时贴壁后，取悬浮细胞，调细胞浓度为2×106/ml，用含10％FCS的CM培养；(2)分为两组培养淋巴细胞：实验一组(加IL-2组)：加入IL-2(200U/ml)培养为T淋巴细胞(TLs)；实验二组(加单抗与IL-2组)：加入细胞因子——抗CD3单抗(500ng/ml)和IL-2(200U/ml)，每三天补充IL-2(200U/ml)一次；(3)诱导CTLs：待DCs成熟，第7天将实验二组的淋巴细胞与DCs按10：1的比例混合，用含10％FCS的CM培养，同时加入IL-2(200U/ml)，作用72小时后，收集细胞并计数；(4)分选CD8+CTLs：采用免疫磁珠方法用MidiMACS分离纯化CD8+T细胞亚群；(5)杀伤活性测定：四甲基偶氮唑蓝(methylthiazolyltetrazolium，MTT)法测定杀伤活性，分为三个实验组：第一组：①CD8+CTLs+U937细胞系，②CD8+CTLs+K562细胞系；第二组：①CD8-CTLs+U937细胞系，②CD8-CTLs+K562细胞系；第三组：TLs+U937细胞系。
结果：(1)淋巴细胞形态的改变：实验二组细胞在抗CD3单抗(抗CD3McAb)和IL-2刺激下，细胞明显增大，细胞浆中充满颗粒，其形态与实验一组(加IL-2组)的相同，但实验二组的细胞在抗CD3McAb+IL-2刺激后，细胞集落增多，出现成簇细胞团及细胞集落，而实验一组单纯用IL-2刺激则未观察到此现象。(2)磁珠分选CD8+CTLs纯度：分选前CD8+T淋巴细胞比例为(63.78±10.72)％，CD4+T细胞的比例为(26.56±13.60)％，CD3阳性淋巴细胞比率为(89.23±7.12)％。经MidiMACS分选后的CD8+CTLs纯度为(95.73±1.50)％；CD8-CTLs组中，CD4+T淋巴细胞的比率为(65.01±9.29)％，CD8+T淋巴细胞的比率为(4.90±4.46)％。
(3)各组的杀伤率比较：
①CD8+CTLs对U937的杀伤率：40：1、20：1、10：1效靶比时，杀伤率分别为(66.36±12.43)％、(35.38±9.64)％、(19.04±6.15)％。以40：1的效靶比杀伤率最高(P＜0.05)。
②CD8-CTLs对U937的杀伤率：40：1、20：1、10：1效靶比时，杀伤率分别为(34.47±8.19)％、(21.85±7.06)％、(12.26±4.87)％。以40：1的效靶比杀伤率最高(P＜0.05)。
③TLs组对U937的杀伤率：40：1、加：1、10：1效靶比时，杀伤率分别为(15.79±4.64)％、(9.60±3.71)％、(5.69±3.14)％。40：1的效靶比杀伤率最高(P＜0.05)。
④CD8+CTLs在40：1效靶比时对K562细胞的杀伤率为(41.97±14.24)％，显著低于相同效靶比时对U937细胞的杀伤率(P＜0.05)；CD8-CTLs在40：1效靶比时对K562细胞的杀伤率为(22.45±4.00)％，与相同效靶比时对U937细胞的杀伤率相比无显著性差异(P＞0.05)。
⑤在相同效靶比时CD8+CTLs组对U937细胞的杀伤活性高于CD8-CTLs组和TLs组(P＜0.05)。
全文结论:(1)脐血单个核细胞在GM-CSF、IL-4、TNF-α和PGE2联合培养后，可被诱导成形态典型、功能成熟的树突状细胞。
(2)国内首次用负载U937白血病细胞株抗原的成熟脐血DCs，诱导出脐血淋巴细胞特异性的CD8+CTLs。
(3)CD8+CTLs对U937白血病细胞株的杀伤活性强于CD8-CTLs。
(4)CD8+CTLs对U937白血病细胞株杀伤具有特异性。