【摘 要】
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随着经济水平的提升,人与自然环境的接触逐渐增多,埃里希氏体引起的埃里希氏体病及伯氏疏螺旋体引起的莱姆病等蜱传虫媒性传染病逐渐引起人们的关注,目前主要存在以下问题:（1）尚无可同时检测埃利希氏体和伯氏疏螺旋体的PCR方法,现有的检测方法均过于复杂,不适用于临床样品特异快速检测。（2）我国仍缺少针对埃里希氏体的系统性的流行病学调查,对我国埃里希氏体分布情况还不清楚,故针对蜱携带埃里希氏体情况进行研究具
【基金项目】
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“宠物细菌与真菌传染病诊疗与防控新技术研究” （2016YFD0501005）；
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随着经济水平的提升,人与自然环境的接触逐渐增多,埃里希氏体引起的埃里希氏体病及伯氏疏螺旋体引起的莱姆病等蜱传虫媒性传染病逐渐引起人们的关注,目前主要存在以下问题:（1）尚无可同时检测埃利希氏体和伯氏疏螺旋体的PCR方法,现有的检测方法均过于复杂,不适用于临床样品特异快速检测。（2）我国仍缺少针对埃里希氏体的系统性的流行病学调查,对我国埃里希氏体分布情况还不清楚,故针对蜱携带埃里希氏体情况进行研究具有重要意义。（3）自1983年第一次报道我国存在莱姆病及其自然疫源地后,我国再无针对其病原伯氏疏螺旋体的系统的分子流行病学调查,蜱作为其主要传播媒介,针对蜱携带伯氏疏螺旋体情况进行系统的分子流行病学调查,对我国莱姆病的防控具有指导意义。针对上述问题,本研究建立了埃里希氏体和伯氏疏螺旋体双重荧光定量PCR检测方法;对我国部分地区蜱携带埃里希氏体情况进行分子流行病学调查,以了解埃利希氏体分布情况提供信息;对我国部分地区蜱携带伯氏疏螺旋体情况进行分子流行病学调查,为莱姆病的防控提供理论依据。主要内容如下:1.埃里希氏体和伯氏疏螺旋体双重荧光定量PCR检测方法的建立本研究针对埃里希氏体gro EL基因和伯氏疏螺旋体osp A基因,建立了双重荧光定量PCR方法,对其特异性、灵敏性、重复性、与以往的普通PCR方法的一致性进行了研究,并运用该方法对我国黑龙江省、吉林省、辽宁省和北京市的150只（25组）全沟硬蜱样品进行检测。结果表明:本方法仅可特异性扩增埃里希氏体及伯氏疏螺旋体的基因,对钩端螺旋体、立克次体、大肠杆菌、绿脓杆菌基因组扩增均为阴性,与传统的PCR方法一致,最低核酸检测限为:1×10~1copies/μL,批内与批间重复试验Tm值的变异系数均小于0.1%。埃里希氏体和伯氏疏螺旋体的检出率分别为32%和20%,传统PCR方法检出率分别为24%和16%。以上结果说明,本研究建立的方法特异性好、灵敏度高、重复性强,能同时检测埃里希氏体和伯氏疏螺旋体,可用于蜱传疾病的分子流行病学调查和鉴别诊断。2.我国部分地区蜱携带埃里希氏体分子流行病学调查本研究于2017-2019年间在黑龙江省佳木斯市、伊春市、吉林省四平市、辽宁省丹东市和北京市从牛和犬的体表共采得蜱样品1470只,分为354组后提取蜱基因组DNA,选用以及本课题所建立双重荧光定量PCR方法以及埃里希氏体gro EL、dsb和16S r RNA基因引物进行PCR鉴定并对获得序列进行遗传进化分析,发现阳性样品共20组,其中:Ehrlichia muris（10株）、Ehrlichia ewingii（3株）、Candiatus Neoehrlichia mikurensis（3株）、Anaplasma phagocytophilum（1株）、Anaplasma bovis（1株）、Ehrlichia ruminantium（1组）、Ehrlichia minasensis（1株）。样品总阳性率为5.64%,其中黑龙江省阳性率为5.23%（16/306）;黑龙江省全沟硬蜱阳性率为28.3%（15/53）;吉林省阳性率为9%（4/44）;辽宁省阳性率为0%（0/2）;北京市阳性率为0%（0/2）。3.我国部分地区蜱携带伯氏疏螺旋体分子流行病学调查本研究对354组蜱基因组DNA进行分子流行病学调查,选用本课题所建立双重荧光定量PCR方法以及伯氏疏螺旋体5s-23s r RNA间隔序列、rec A和osp A基因引物进行巢式和普通PCR鉴定并对获得序列进行遗传进化分析,样品总计354组,发现阳性样品共11组,均属于Borrelia garinii。其中总阳性率为3.1%（11/354）;黑龙江省阳性率为3.27%（10/306）;黑龙江省全沟硬蜱阳性率为18.86%（10/53）;吉林省阳性率为2.23%（1/44）;辽宁省阳性率为0%（0/2）;北京市阳性率为0%（0/2）。
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