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小菜蛾Plutella xylostella (L.)属于鳞翅目菜蛾科,是一种世界性的重要农业害虫。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是一种能产生杀虫晶体蛋白(Insecticidal crystal proteins, ICPs,又称为d-内毒素)的革兰氏阳性细菌,因其对害虫高效、对非靶标生物安全、对环境友好,在世界范围内得到了广泛的应用。1990年,Tabashnik等首先报道了田间小菜蛾对Bt制剂的抗药性,至今已有小菜蛾(Plutella xylostella)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)、玉米钻心虫(Osreinia furnaialis)和红铃虫(Pectinophora gossypiella)等6种重要农业害虫田间种群已对Bt制剂或转Bt基因作物产生了抗药性。害虫抗药性治理依赖于对害虫抗性机制的阐明,但遗憾的是,到目前为止人们对Bt的抗性机制仍知之甚少。本论文从抗性与敏感小菜蛾品系内克隆获得了与Bt杀虫蛋白抗性可能相关的氨肽酶N(APN2)基因,构建了相关的表达载体并在昆虫细胞Sf9细胞系中进行了表达,最后研究了表达蛋白与Cry1Ac的结合特性。具体内容与结果如下：1、抗性与敏感品系小菜蛾中肠氨肽酶N(APN2)基因全长的克隆与分析本研究根据GenBank上登录的APN2基因序列(登录号：GU479677.1)设计全长引物,克隆了抗性及敏感品系小菜蛾中肠APN2基因全长。结果表明：小菜蛾中肠APN2基因全长编码区(开放阅读框ORF)长度为2853bp,编码950个氨基酸,通过Compute pI/Mw tool软件预测得到目的基因APN2的蛋白质分子量为107kDa；与已登录的小菜蛾APN2核苷酸序列同源性为98%；比较抗性品系与敏感品系小菜蛾APN2基因,发现两者有4个氨基酸差异,分别是APN2-S的120Phe、344Glu、706Asp和709Phe突变为了APN2-R的120Val、344Lys、706Glu和709Tyr。2、抗性与敏感品系小菜蛾中肠氨肽酶N(APN2)基因在昆虫细胞Sf9细胞系中的表达将抗性和敏感小菜蛾APN2基因连接到pFastBac HTB上,并利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功构建了APN2和GFP基因的重组杆状病毒,在Sf9细胞系中进行了表达。结果表明：SDS-PAGE分析发现表达蛋白分别在107和27kDa处发现一条特异性条带,表达含有GFP蛋白的细胞具有明显绿色荧光；Western blotting分析,发现表达的敏感与抗性小菜蛾中肠APN2蛋白与抗His标签抗体成功结合,并在107kDa处出现了一条特异性条带,证实目的基因得到成功表达。3、抗性与敏感品系小菜蛾中肠氨肽酶N(APN2)重组蛋白的功能分析通过Far-western blot、免疫荧光定位以及Cry1Ac毒素对Sf9细胞的毒性等方法,对表达获得的抗性、敏感小菜蛾中肠氨肽酶N(APN2-S/R)重组蛋白进行了功能分析。结果表明：Far-western blot分析发现抗性、敏感小菜蛾APN2蛋白均能与Cry1Ac母素蛋白相结合；免疫荧光定位分析研究发现,只有表达APN2-S/R蛋白的Sf9细胞才有绿色荧光出现；Cry1Ac毒素对Sf9细胞的毒性分析发现,只有表达APN2蛋白的Sf9细胞在Cry1Ac毒素蛋白的孵育下,细胞发生明显裂解,细胞死亡数明显上升,差异性极显著(P<0.01)。