【摘 要】
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随着人类活动的增加,环境污染不断加剧,生物修复因其低成本、低能耗、对环境友好等优点而成为环境修复的首选方法。地球表面的大部分区域为低温环境,但低温环境生物修复普遍存在效率低、周期长、能耗和成本高等问题,是环境保护领域的世界性难题。适冷酶因其较低的最适催化温度、高催化效率和热不稳定性等固有特性而成为低温环境生物修复的宝贵工具。本课题组前期发现并报道了一种新的具有适冷活性的2,4-二氯苯酚羟化酶Tfd
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随着人类活动的增加,环境污染不断加剧,生物修复因其低成本、低能耗、对环境友好等优点而成为环境修复的首选方法。地球表面的大部分区域为低温环境,但低温环境生物修复普遍存在效率低、周期长、能耗和成本高等问题,是环境保护领域的世界性难题。适冷酶因其较低的最适催化温度、高催化效率和热不稳定性等固有特性而成为低温环境生物修复的宝贵工具。本课题组前期发现并报道了一种新的具有适冷活性的2,4-二氯苯酚羟化酶Tfd B-JLU,该酶是参与国际上广泛使用的除草剂2,4-二氯苯氧基乙酸（2,4-D）降解反应过程中的一个关键酶,但是该酶的适冷性机制尚不清楚。本论文旨在通过对Tfd B-JLU序列和结构的分析,分子对接和分子动力学模拟,结合理性设计,探索其适冷性结构特征;通过酶分子热力学和动力学研究,探究其热动力学变化规律与适冷性关系,综合以上研究,初步解析Tfd B-JLU酶适冷性的分子机制。本研究的主要内容和研究结果如下:（1）Tfd B-JLU结构构建和评估;结构是功能的基础,决定着蛋白质的生物学功能,也是研究功能背后机制的前提。由于Tfd B-JLU还未解析出晶体结构,对于研究其适冷机制有一定的局限性。本研究利用Alpha Fold2对Tfd B-JLU进行结构构建,并通过Ramachandran plot、Profiles-3D和Z-score值对构建的蛋白结构进行评估,结果显示构建的蛋白结构高度可信。（2）基于结构的位点预测和验证;通过总结几种适冷酶的结构特征发现,适冷酶与适冷性相关的结构特征因酶而异,需要与适冷酶的中温或嗜热同系物进行序列及结构比对分析来总结。为了探究Tfd B-JLU与适冷性相关的结构特征,本论文将Tfd B-JLU和两种中温Tfd B酶（分别来自目前研究最多且最深入的Cupriavidus necator JMP134和与Tfd B-JLU高同源性的Cupriavidus oxalaticus）进行结构比对和分子动力学模拟研究。结果发现Tfd B-JLU相对于两种中温同源酶,结构柔性更强。通过分析发现,Tfd B-JLU高柔性与盐桥、氢键、Arg、Asp、表面电荷、Arg/Lys的比值及带电和极性不带电氨基酸的比例均减少,小氨基酸和中性氨基酸的比例及表面疏水氨基酸比例较高和较多的长loop区密切相关。基于Tfd B-JLU柔性结构相关的结构特征,对可能对Tfd B-JLU适冷性起关键作用的氨基酸进行了初步预测,构建了突变库并制定了突变策略,通过理性设计进行验证,探究这些位点与适冷性的相关性。结果发现L249G和P316G的适冷性得到了进一步提升,Q423如预期猜想一致,适冷性降低,推测L249、P316和Q423可能与Tfd B-JLU的适冷性相关。（3）Tfd B-JLU热动力学和适冷机制研究;适冷酶在低温下的高催化效率得益于其独特的适冷机制。为了探究Tfd B-JLU的适冷机制,本论文通过生物信息学分析和实验数据测定两方面对适冷性较好的突变体进行热动力学研究。通过分析发现突变体均呈现出减少?H?和增加?S?的趋势,与其他类型适冷酶的基本热动力学特征变化趋势一致。同时,焓熵的变化使L249G、M251G和M251G/P316Q等突变体增加了底物混杂性,可能存在底物非专一性和适冷性共进化的特征。对突变体M251G与M251G/P316Q进行动力学参数测定发现,突变体M251G和M251G/P316Q与2,4-DCP的亲和力都明显高于野生型。结合热动力学特征和结构特点分析,Tfd B-JLU的适冷可能主要受活性中心和活性口袋区域的氨基酸调控,远端区域对适冷性影响较小。该酶可能是通过增加局部结构柔性,减少反应过程中的能量消耗,并通过熵焓补偿提高低温催化效率来完成其适冷性进化。综上所述,本论文对Tfd B-JLU适冷性相关的结构特征进行了预测和评估,初步掌握了一些与其适冷性相关的结构特征,结合热动力学特征研究,对Tfd BJLU适冷机制有了初步认识,为最终解析其机制奠定了重要基础。本研究对于适冷酶的进化,丰富和发展寒冷地区芳香族类污染物的生物修复具有重要意义。
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