【摘 要】
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雄性特异性致死复合物（Male-specific lethal complex,MSL）最初在果蝇的剂量补偿研究中被发现,在细胞中可以特异性地乙酰基化组蛋白H4K16位点。果蝇和哺乳动物细胞中的MSL复合物的主要成分高度保守。近年来,越来越多的研究证实MSL复合物与多种肿瘤的发生发展密切相关。MSL2（Male-specific lethal 2）是MSL复合物中唯一具有RING finger结构
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雄性特异性致死复合物（Male-specific lethal complex,MSL）最初在果蝇的剂量补偿研究中被发现,在细胞中可以特异性地乙酰基化组蛋白H4K16位点。果蝇和哺乳动物细胞中的MSL复合物的主要成分高度保守。近年来,越来越多的研究证实MSL复合物与多种肿瘤的发生发展密切相关。MSL2（Male-specific lethal 2）是MSL复合物中唯一具有RING finger结构域的成员,在不同物种间高度保守,最近研究发现MSL2独立于MSL复合物,与多种蛋白结合,提示MSL2可能非依赖于MSL复合物参与调节细胞内的生物学过程。后续研究发现MSL2可能在基因转录调控、RNA聚合酶Ⅱ合成、线粒体依赖性凋亡以及非同源末端连接等过程中发挥重要作用,表明MSL2在细胞中具有自身特异的调控机制。目前,有关MSL2在细胞内的确切分子机制并不十分清楚,尤其是,MSL2在肿瘤发生发展过程中的作用及其调控机制鲜有报道。本研究以临床常见的宫颈癌作为研究对象,以宫颈癌HeLa细胞和HEK293T细胞为实验模型,通过构建CRISPR/Cas9-MSL2敲除（MSL2-KO）细胞系和pLVX-MSL2慢病毒敲低（MSL2-KD）质粒、pcDNA3.1-MSL2过表达质粒,结合免疫印迹、免疫沉淀、细胞免疫荧光染色、反转录聚合酶链式反应以及双荧光素酶活性检测等生物学技术,初步探讨了MSL2在对宫颈癌细胞中的作用以及其可能的分子机制。本论文的研究结果归纳如下:1.成功构建了MSL2-KO、MSL2-KD/HDAC1-KD和MSL2/HDAC1过表达质粒,为后续研究MSL2在细胞内的生物学功能奠定了实验基础:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了MSL2-KO细胞系;利用慢病毒干扰系统成功构建了pLVX-sh MSL2和pLVX-sh HDAC1敲低质粒;利用pcDNA3.1载体成功构建了带有不同标签,可在哺乳动物细胞中表达的MSL2和HDAC1质粒。2.MSL2正向调控组蛋白去乙酰化酶1（Histone deacetylase 1,HDAC1）的蛋白水平,提示MSL2与HDAC1之间的互作关系:利用前述构建好的MSL2敲低或过表达质粒结合细胞实验发现,MSL2可以正向调控HDAC1的蛋白水平,但不影响HDAC1的m RNA水平;反过来,干扰细胞内HDAC1的表达或过表达HDAC1也仅影响MSL2的蛋白表达水平,提示MSL2与HDAC1之间可能是翻译后的互作关系。另外,细胞免疫荧光染色实验证实MSL2与HDAC1在细胞核中共定位。3.共转染/免疫共沉淀实验证实MSL2和HDAC1之间相互结合,提示二者在细胞内可能协同发挥作用:在HEK293T细胞中共转染不同标签的MSL2和HDAC1,并通过免疫共沉淀的方法证实MSL2和HDAC1之间相互结合。同时,利用免疫沉淀结合泛素化特异抗体证实,MSL2可以对HDAC1进行泛素化修饰。4.MSL2和HDAC1可能协同参与调控上皮-间充质转化过程（Epithelialmesenchymal transition,EMT）:通过共转染pcDNA3.1-MSL2和p GL4-Snail-Luc报告基因质粒进行双荧光素酶活性检测,并结合免疫印迹实验证实,MSL2可以转录抑制Snail的表达,进而抑制EMT进程和HeLa细胞的迁移,相反,敲低MSL2的表达,则促进EMT进程。而干扰MSL2对EMT的促进作用可被过表达HDAC1所拮抗,提示MSL2和HDAC1协同调控EMT进程。综上,本研究通过不同生物技术和实验方法,证实了MSL2与HDAC1之间相互作用关系,并阐明了二者对EMT过程的调控机制,为后续研究抗肿瘤药物的靶向设计和肿瘤的靶向治疗提供实验依据。
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