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研究目的:肝细胞肝癌已位列第二大致死性肿瘤,其高发病率和高致死率的主要原因是血管侵犯和转移。因此对于肿瘤转移和血管生成的进一步研究,将会更好地提升肿瘤的抗血管治疗效果,提升肝癌患者的生存质量。本实验检测LOXL2(lysyl oxidase like 2)、上皮-间充质转变(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关分子SNAIL、血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)形成的标记蛋白VE-cadherin及细胞极性蛋白LLGL2(Lethal giant larvae2)在肝癌中的表达情况并探讨它们之间的关系;然后分析LOXL2的表达与年龄、性别、肿瘤大小及临床分期等各种临床资料的关系;探究LOXL2与VM两者对于肝细胞肝癌(HCC)的生存时间及其临床预后的影响,从而更好地阐述LOXL2对于肝细胞肝癌VM形成、转移及预后的影响和意义。同时在体外实验中细胞转染、分子生物学技术等方法来进一步探究LOXL2对于体外肿瘤细胞的成管、侵袭和迁移能力影响,从而了解其对于肿瘤细胞的转移能力及VM形成的影响。总之,对于LOXL2在肝细胞肝癌VM形成及临床预后的影响的初步研究,将会为肝细胞肝癌的诊断治疗寻找到潜在的预后预测分子,并为肝细胞肝癌的治疗提供一定的借鉴。研究方法:1.收集来自天津医科大学肿瘤医院和天津医科大学总医院的201例肝细胞肝癌病例,采用免疫组化方法检测肝细胞肝癌样本中LOXL2、LLGL2、SNAIL和VE-cadherin的表达情况并分析他们之间的相关性,然后采用CD31/PAS双染的方法检测肝细胞肝癌中VM的情况并分析VM与其他蛋白表达的相关性。同时,为了进一步了解肝细胞肝癌组织内LOXL2及相关分子在m RNA水平的情况,我们针对64例肝癌冰冻组织进行了实时定量PCR(q RT-PCR)的实验来检测LOXL2与其相关基因的表达情况。第二,针对201例临床病例资料进行回顾性分析,结合临床资料通过X2和Spearson相关分析来研究LOXL2表达与年龄、性别、肿瘤大小、VM形成及临床分期等临床资料的关系;第三,采用判别分析对160例HCC病例建立判别公式,并在剩余60例肝癌病例中,对比分析来检测LOXL2对于肝癌转移的预测价值;最后,采用Kaplan-Meier来探究LOXL2和VM形成对于肿瘤患者生存时间及两者共同对于肿瘤患者生存时间的影响;并采用Cox比例风险模型分析LOXL2对于肝细胞肝癌预后的价值。2.稳定转染筛选构建出LOXL2高表达/降表达的肝细胞肝癌细胞系,进而通过体外三维培养来观察LOXL2对于体外VM形成能力的影响,并通过划痕、Transwell侵袭等细胞功能学实验来初步观察LOXL2对于肿瘤细胞迁移和侵袭能力的影响。研究结果:1.针对201例肝细胞肝癌病例的免疫组化结果显示:LOXL2在肝癌细胞中的胞质和胞核中均表达,SNAIL大部分在肝癌细胞的胞核中表达,LLGL2表达于肝癌细胞的胞质,而VE-cadherin在肝癌细胞中的胞核中表达。201例肝细胞肝癌中,LOXL2在胞浆中表达率为52.2%,在胞核的表达率为52.7%;SNAIL阳性率为76.1%;而VE-cadherin阳性率为21.9%;而LLGL2的阳性率为24.3%。相关性分析显示:LOXL2浆表达、EMT调控者SNAIL的核表达及VM的标记物VE-cadherin的浆表达之间分别存在着一定的相关性(R=0.165 P=0.019;R=0.235P=0.001;R=0.152 P=0.031;R=0.071 P=0.031);而LOXL2的核表达,LLGL2的浆表达及VE-cadherin的表达却与其他蛋白不相关(R=0.110 P=0.119;R=0.043P=0.541;R=0.069 P=0.324)。2.q RT-PCR的结果显示:结果显示:LOXL2、Snail、VE-cadherin等蛋白在肝细胞肝癌组的m RNA表达水平明显高于其在正常组中的表达水平(P=0.033,P=0.034,P=0.024)。而细胞极性形成的相关蛋白LLGL2则正好相反(P=0.045)。相关性分析显示:在m RNA水平上,LOXL2与SNAIL、VE-cad正相关,与LLGL2负相关,这与免疫组化中的相关性分析是一致的。3.免疫组化CD31-PAS双染结果显示:201例肝细胞肝癌病例中,48的肝癌病例发现了VM的存在。而153例没有发现VM的存在。在VM形成组的48例中,34例的肝细胞肝癌病例中LOXL2浆表达,表达率高达70.8%,而相应的无VM形成组153例肝癌病例中,仅有约占46%(71例)的病例呈现LOXL2浆表达。两组之间存在显著性差异(p=0.005);相关性分析也显示LOXL2的表达与VM形成呈正相关的关系(r=0.209,p=0.003)4.LOXL2的临床病理资料分析显示:LOXL2蛋白的浆表达在转移组中的阳性率明显大于其在非转移组的阳性率。另一个因子SNAIL作为EMT的相关因子在转移组也呈现高表达的水平,且表达水平与非转移组相比具有显著性差异(P=0.002)。同时LOXL2在病理分级III+IV组中的蛋白表达水平明显高于I+II组(P=0.002)。即,LOXL2在201例肝细胞肝癌组织中的浆表达与肿瘤分级和转移等临床病理特征密切相关,而跟病人的年龄、性别及肿瘤大小未见明显相关。而跟病人的年龄、性别及肿瘤大小未见明显相关(P=0.302;P=0.337;P=0.388)。同时判别分析显示LOXL2对于肝癌转移的预测具有很好的价值。5.Kaplan-Meier生存分析显示:LOXL2浆表达的患者其总体生存时间(OS)和无病生存时间(DFS)明显地较LOXL2浆表达阴性的患者短(P<0.005)。VM阳性表达的病例相比于VM阴性表达的病例其总体生存时间(OS)和无病生存时间(DFS)更短(P<0.005)同时具有VM和LOXL2浆表达的病例组,其DFS和OS平均值相比于不是VM形成和LOXL2浆表达的双阳的病例组明显较短(P=0.000)。Cox分析显示:LOXL2浆表达和VM形成是病人整体生存时间(P<0.001;HR=2.155;CI:1.123–4.136;P<0.05;HR=3.378;CI:1.942–5.878,P<0.05)和无病生存时间(P<0.001;HR=1.782;CI:1.037–3.063;P<0.05;HR=3.705;CI:2.282–6.016,P<0.01)的独立预后因子。6.在体外三维培养实验结果显示:高表达LOXL2蛋白的Hep G2-LOXL2上调细胞系中,细胞在三维实验中的管道样结构形成能力明显较对照组Hep G2-control细胞系明显提升。另一方面在稳定降表达LOXL2蛋白的Bel7402-sh LOXL2细胞系,其在三维实验中的管道样结构形成能力较对照组呈明显性降低。7.在体外划痕迁移和Transwell侵袭实验中,高表达LOXL2蛋白的Hep G2相比对照组细胞系其迁移和侵袭能力明显提升(P<0.05);而经转染浆表达LOXL2蛋白的Bel7402-sh LOXL2相比对于对照组的Bel7402-control细胞系其迁移和侵袭能力明显降低(P<0.05)。8.针对肝细胞肝癌细胞系的实时定量PCR的结果显示:LOXL2m RNA的高表达促进VM形成的标记蛋白VE-cadherin的m RNA水平的表达,并降低细胞极性蛋白LLGL2的m RNA水平的表达(P<0.05),但是对于SNAIL的促进效果却不明显;另一方面,LOXL2m RNA的低表达将会抑制VM形成的标记蛋白VE-cadherin的m RNA水平的表达,同时促进细胞极性蛋白LLGL2的m RNA水平的表达(P<0.05),但是对于SNAIL的抑制效果并不明显;。研究结论:1.LOXL2浆表达与临床分级和转移明显相关,而与年龄及性别等临床资料不相关。2.LOXL2促进肝细胞肝癌中VM的形成,并与肝癌的不良预后密切相关。3.LOXL2浆表达和VM形成是病人整体生存时间和无病生存时间的独立预后因子。4.LOXL2以促进肿瘤细胞的侵袭、迁移能力及管道样结构形成能力。5.LOXL2可能通过促进SNAIL,抑制LLGL2从而促进EMT和VM形成。