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琼胶寡糖是琼脂糖降解后产生的水溶性糖,与琼脂糖相比,琼胶寡糖在食品、医药及生物科技等领域具有更广阔的应用。本课题组自西太平洋深海沉积物中获得一株太平洋火色杆菌(Flammeovirga acifica WPAGA1),前期研究发现该菌能直接降解龙须菜中的粗琼胶产寡糖,并建立了“一步法”产寡糖的工艺。然而,由于龙须菜粗琼胶中的硫酸基团含量很高,目前研究的琼胶酶均无法以其做为底物,而且没有相关代谢机制的研究报道,因此阐明该菌对粗琼胶的代谢机制具有重要的意义。本文针对此开展研究,主要研究内容和取得的成果如下:(1)菌株WPAGA1能利用多种多糖为唯一碳源生长,包括琼胶、卡拉胶、阿拉伯半乳聚糖、淀粉、海藻酸、几丁质、纤维素、岩藻聚糖、紫菜聚糖及木聚糖,胞外酶活性研究表明,菌株WPAGA1能分泌与上述9种复杂多糖相应的多糖降解酶,其中对琼胶的活性最高,卡拉胶次之。琼胶降解实验发现菌株WPAGA1能利用琼胶为唯一碳源生长,并且能分泌至少6个琼胶酶。(2)为了从基因水平揭示菌株WPAGA1多糖降解能力,对该菌株进行了基因组测序,结果表明,菌株WPAGA1基因组大小约为6.6 M,G+C含量为32.89%,共有5036个编码基因,以及基因岛、ncRNA、CRISPR等丰富的基因组元件,利用KEGG、COG、GO及CAZy等数据库对菌株WPAGA1基因组数据进行功能预测,发现碳水化合物代谢相关的酶基因非常丰富,共预测到了 1022个与碳水化合物代谢相关的酶基因。本文着重对琼脂糖代谢的相关酶基因进行了预测和分析,发现16个琼胶酶。氨基酸序列分析表明,其中,有10个琼胶酶归类为GH86家族,4个为GH16家族,2个GH50家族。此外,还预测到了 4个GH117家族的糖苷水解酶基因 NABH4900、NABH4454、NABH4989 和 NABH4302,1个 AHGA 环化酶 AHGAC4986 和两个 AHG 脱氢酶 AHGD4985、AHGAC4649。基于这些相关的酶,本文预测了菌株WPAGA1将琼脂糖降解为可利用的单糖的完整代谢途径。(3)通过相关酶的重组表达与活性研究,对上述代谢途径进行了体外验证。结果表明,菌株WPAGA1基因组中的琼胶酶Aga4007、Aga2593、Aga4779、Aga950及Aga1974能将琼脂糖降解为新琼四糖及新琼六糖,随后这两种新琼寡糖被GH50家族的琼胶酶Aga2660降解为新琼二糖,新琼二糖被GH117家族的NABH4454降解为D-半乳糖及3,6-内醚-L-半乳糖(AHG),AHG被AHGD4985及AHGAC4986酶解产生KDGal,最后进入TCA循环,而D-半乳糖进入半乳糖代谢。此外,本文还发现,菌株WPAGA1基因组中具有丰富的硫酸酯酶基因。研究表明,重组硫酸酯酶(Su11971)能降解龙须菜中的粗琼胶产生游离的硫酸基团,与重组琼胶酶联合作用时,提高琼胶酶降解粗琼胶产生还原性寡糖的活性,表明硫酸酯酶在该菌株降解粗琼胶的代谢途径中起着重要作用。(4)在代谢途径研究的基础上,本文通过不同酶基因的组合表达,以定向制备不同组分的新琼寡糖。利用含Aga4007及Aga2660酶基因的重组质粒pACY-NAB1,在大肠杆菌BL21(DE3)中制备新琼寡糖,当以琼脂糖为原料时,能定向获得新琼二糖,产量约为500 mg/L。但以龙须菜粗琼胶为原料时,产生的新琼二糖浓度较低,约为50 mg/L。为了能够直接以龙须菜琼胶为原料进行生产,以降低成本和污染问题进一步将含硫酸酯酶Su11971的重组质粒pET-Sull以及含Aga4007及Aga2660酶基因的重组质粒pACY-NAB1同时转入大肠杆菌BL21(DE3)中,再以龙须菜粗琼胶为原料进行生产时,新琼二含量提高了 9倍,可达450mg/L。该方法为将来利用基因组数据充分挖掘菌株WPAGA1的应用潜力奠定了基础。