第一部分、荧光偏振方法在组蛋白去甲基化酶抑制剂筛选中的建立和优化　　 研究背景及目的：　　 组蛋白甲基化是组蛋白共价修饰中的一种重要形式。一直以来被认为是一个稳定且不可逆的过程，直到2004年发现第一个组蛋白去甲基化酶LSD1。经过近年的研究，已发现了超过20种的组蛋白去甲基化酶(histone demethylases，HDMs)。根据去甲基化酶的结构和不同的催化机理，可以将去甲基化酶分为两类:一类是黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adeninedinucleotide，FAD)依赖性去甲基化酶，LSD1和LSD2;另一类是依赖于Fe2+和共同作用因子α-酮戊二酸(αKG)，并含有Jumonji结构域的去甲基化酶(JmjCdomain-containing histone demethylases，JHDMs)。它们通过调控与特定基因的转录激活或抑制相关。大量的研究发现它们参与包括癌症在内的多种疾病的发生和进行发展，如前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、食管鳞状细胞癌以及原发性纵隔B细胞淋巴瘤等。　　 组蛋白去甲基化酶在生理和病理中的重要作用使其成为新药开发的靶点，对其抑制剂的研发和筛选也已成为了现阶段组蛋白去甲基化酶研究的热点。基于去甲基化酶作用机制以及蛋白质晶体结构的特点，已经有大量的小分子抑制剂被设计并合成出来。因此，迫切需要一个方便、快速、高效、低廉以及高通量的方法对其进行大规模筛选，发现有效的小分子去甲基化酶抑制剂。　　 研究方法：：　　 我们通过建立荧光偏振方法应用于组蛋白去甲基化酶小分子抑制剂的筛选。基于实验室已发现的JHDMs小分子抑制剂methylstat的结构，我们设计合成了荧光探针SY-Ⅱ-082、WQX-Ⅶ-291和WQX-Ⅶ-417等，并在荧光偏振实验过程中进行结构优化。在建立荧光偏振结合体系时，我们首先优化了缓冲液条件和荧光探针浓度。由于探针本身含有αKG结构，我们又对金属离子FeⅡ和外层电子排布与FeⅡ相似的NiⅡ对结合体系的影响进行了检测，并进一步优化了NiⅡ浓度;还对信号的稳定性进行检测。　　 通过优化的结合体系，我们对荧光探针分子与去甲基化酶的亲和能力进行测定，并利用改良的解离常数计算公式在KaleidaGraph中拟合曲线得到两者的Kd值。接下来，通过对所需蛋白浓度的优化以及小分子抑制剂与荧光探针分子背景结合信号的检测，我们优化了荧光偏振竞争体系。我们通过对JHDMs常用抑制剂的滴定(IC50)来确定荧光偏振竞争实验的可行性后，还检测了Z因子(0＜Z＜1)以证明此方法是否可用于高通量筛选。　　 研究结论：　　 利用对实验体系的一系列优化，我们最终建立了一个稳定的可用于去甲基化酶抑制剂筛选的荧光偏振方法，可在同一背景下检测所有小分子抑制剂与去甲基化酶的结合能力Ki，避免了不同方法检测到的半数抑制浓度IC50值无可比性的缺点;同时筛选出一个特异性结合JHDM1A的荧光探针WQX-Ⅶ-417，可用于针对JHDM1A的小分子抑制剂的筛选。　　 荧光偏振结合实验的优化结果显示，1nM的荧光探针WQX-Ⅶ-417本身具有较强的稳定的荧光信号;Tris缓冲液较HEPES缓冲液能拟合出更优曲线;FeⅡ无论在还原剂是否存在的条件下，都会干扰结合信号，不能产生正常的结合曲线;NiⅡ能够在体外反应中保持结合信号的稳定，替代体内反应中所需的FeⅡ。相比JMJD2A，探针WQX-Ⅶ-417能够特异性地较强地结合JHDM1A（ΔmP约为280，Kd值仅为10.8 nM）。这一结果为小分子抑制剂的筛选提供了较大筛选窗，利用此探针可以筛选出Ki大于10nM的JHDMs小分子抑制剂。　　 荧光偏振竞争实验的优化结果显示，60 nM的JHDM1A即可用于竞争结合实验。常用小分子抑制剂滴定结果显示methylstat能够将相似结构的探针分子WQX-Ⅶ-417竞争下来，亲和能力较高（Ki约为12.8 nM），证明了其作用机制及设计理念的合理性，并第一次测出了共同作用因子αKG与去甲基化酶的亲和能力;滴定结果还说明此方法可用于抑制剂的筛选。此外，测定此实验方法的Z因子为0.75显示其较适用于高通量筛选(＞0.7)。　　 研究意义：　　 荧光偏振方法通过检测小分子抑制剂与不同去甲基化酶的亲和能力，实现对小分子抑制剂文库的初步筛选，得到具有较高亲和力的抑制剂，为体内实验提供候选抑制剂小分子，并为优化设计新的小分子抑制剂以及研究小分子抑制剂的结构活性关系(Structure activity relationship, SAR)提供重要的线索。此外，此方法还可用于筛选合成修饰的肽链库，通过体外检测不同结构修饰的肽链与组蛋白去甲基化酶结合的特异性，为体内发现新的去甲基化酶提供线索。　　 综上所述，此种荧光偏振方法不仅为去甲基化酶小分子抑制剂筛选提供高效便利的方法，也为生物过程的机理研究提供重要的工具和线索，对建立成熟高效的去甲基化酶小分子抑制剂筛选平台以及研究相关疾病的机理具有重要的应用价值，应用前景较好。　　 第二部分、HPS1基因缺失对眼黑色素体的影响　　 研究背景及目的：　　 HPS综合征是一种常染色体隐性遗传病，是一种特殊的白化病，可由多个基因突变引起。目前已发现并克隆了导致小鼠HPS的15个基因以及所对应人的8个基因。临床上，HPS综合征可导致白化、出血倾向、肺部纤维化引起的呼吸衰竭、肠道感染和视力降低。　　 目前，对HPS1突变小鼠模型pale ear（ep）背部皮肤的色素沉着已有深入研究，发现HPS1突变并不影响毛囊中的黑色素体，但是会降低表皮和真皮毛囊间黑色素体的数目，引起尾部黑色素体的不成熟，从而形成了ep小鼠的特殊毛色模式—背部色素沉着正常呈黑色，而耳朵、尾巴和爪子着色较浅呈近白色。对于同样含有黑色素体的眼则未见系统的报道。在人类中已发现HPS1患者视力下降并伴随着眼球水平摆动震颤。为对HPS1突变所导致视力下降的原因提供研究线索，我们利用HPS1突变小鼠ep为模型，对ep小鼠眼黑色素的起源、分布以及形态进行系统研究。　　 研究方法及结果：　　 采集不同发育阶段ep小鼠的眼球，通过黑色素含量测定、冷冻切片、HE染色、免疫荧光和电镜等方法，我们对眼不同发育阶段含有黑色素细胞的组织进行了生化、光镜和电镜的检测。结果发现，ep小鼠在出生时整体黑色素含量就低于正常小鼠，这种差异随着发育逐步增大;通过进一步的光学显微镜检测发现，虹膜、睫状体以及脉络膜/视网膜色素上皮的色素沉着都低于同时期的正常小鼠;电镜结果显示虹膜内起源于神经脊的虹膜基质中黑色素体异常，表现为巨大黑色素体，而在来源于视杯上皮的色素细胞，前虹膜色素上皮和后虹膜上皮中黑色素体数目大量减少，并没有产生巨大黑色素体。　　 结论：　　 HPS1的缺失可导致起源于神经脊的黑色素细胞形成巨大黑色素体，而使来源于视杯色素上皮的黑色素细胞中黑色素体数目降低但并不产生巨大黑色素体。这个结果与之前对ep小鼠中起源于神经脊的脉络膜与起源于视杯的视网膜色素上皮中黑色素体的形态研究一致，证明了所得结论的正确性。　　 研究意义：　　 此研究结果详细的阐述和证明了HPS1基因缺失对眼黑色素体的影响，为HPS1患者眼内黑色素体的分布及异常提供了详细的形态学资料及发育起源证据;但仍需进一步研究HPS1对不同发育来源的黑色素体形态造成影响的机制，探寻HPS1在眼黑色素体发生、成熟和运输过程中的作用，从而为研究HPS1患者视力下降以及开展相关治疗提供有力线索。