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目的:干细胞的心肌诱导分化是一个连续但分阶段的过程,涉及内在转录调控程序和外源调节信号二者的协同。外源信号对心肌分化的影响,取决于细胞所处分化状态,因而展现了明显的阶段特异性和剂量依赖性。在心肌多阶段程序分化的进程中,有多个信号转导通路的参与,包括TGF-β、Wnt、Notch和Hedgehog等。这些通路在细胞不同的分化阶段,发挥了各自独特的作用,影响了细胞在分化节点的命运选择。通过调节这些信号通路,可引导细胞定向分化,制备性质均一、数量充沛的心肌细胞。一些小分子化合物对心肌分化的影响是现在研究的热点之一。4-PBA是一种小分子化合物,可以作为内质网应激的抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂。细胞在分化的过程中需要合成酶、抗体、血清蛋白以及细胞外基质等成分,内质网腔中会负载大量的新合成蛋白质。且干细胞在定向诱导心肌分化的过程中,前期需要悬浮培养形成拟胚体,拟胚体是一个三维球状结构;到了中后期细胞需要贴壁培养,并迅速形成复层结构,其内部细胞可能存在氧气不足、能量缺乏等情况,这些都可能会导致内质网应激反应。染色质结构的表观遗传调节是胚胎发育过程中基因激活或抑制的基础,其在干细胞心肌分化过程具有重要作用。本课题想探究4-PBA作为一种小分子化合物,对心肌分化有什么影响,且是到底是哪种机制在起作用,能否通过减缓内质网应激从而促进的分化,或者4-PBA是否是通过乙酰化的作用来影响心肌的分化,为胚胎干细胞向心肌分化效率的提高提供方法,为获得大量成熟、纯净且具有功能性的心肌细胞应用于临床提供希望。研究内容:探究在胚胎干细胞定向诱导分化的不同阶段,加入4-PBA对心肌分化的影响,并深入分析4-PBA对胚胎干细胞定向诱导分化的作用机制研究方法:1.以小鼠胚胎干细胞R1作为实验材料,用10-4MVC作为诱导剂,建立心肌分化模型。肉眼观察跳动拟胚体的数目,免疫荧光染色,观察α-肌辅蛋白表达以及real-time PCR检测不同时间段心肌特异性转录因子的表达,确定分化模型是否建立成功。2.在心肌分化的不同阶段收细胞提取RNA,real-time PCR检测内质网应激相关基因以及乙酰化修饰相关基因的表达。3.分不同时间段加入4-PBA,观察对拟胚体跳动数目的影响,初步确定4-PBA对心肌分化的影响。细化时间段,确定最佳加药时间。在不同时阶段的最佳加药时间内分别加入4-PBA、内质网应激激动剂衣霉素(TM)以及组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠(NaB),对照组加入DMSO,观察拟胚体跳动的数目,real-timePCR检测不同阶段心肌特异性标志分子,westemblotting检测心肌特异性蛋白的表达。4.转染内质网应激标志基因pRK-ATF4,real-time PCR检测对心肌特异性标志分子的影响。研究结果:1.心肌分化模型的建立用10-4MVC做诱导剂,第1-5天在细菌培养皿中悬浮培养,在悬浮培养的第三天就可以看到有拟胚体的形成,边缘光滑且中央呈黑色,第5天后贴壁培养,在贴壁培养的第7-9天左右会看到有自发跳动的拟胚体,到贴壁培养的第7天跳动拟胚体的数目达到峰值。选取诱导分化第12天的细胞胰酶消化,免疫荧光染色,可以发现心肌特异性α-肌辅蛋白表达,并且有明显的肌小节结构。选取诱导分化的第0、3、5、7、9、12天收细胞提取RNA,real-timePCR检测发现Nkx2.5与Gata4在诱导分化的第五天开始明显升高。心肌细胞分化晚期特异收缩蛋白基因的表达Myl2、Myl7及Tnnt2在分化的第9天开始显著上调(p<0.01)。表明心肌分化模型建立成功。2.内质网应激相关基因以及乙酰化修饰相关基因的检测选取诱导分化的第0、3、5、7、9、12天收细胞提取RNA,real-time PCR检测内质网应激相关基因以及乙酰化修饰相关基因表达谱,发现Bip、ATF4、Xbp1的表达随着诱导时间的增加先降低,再升高再降低,在第12天的时候显著升高,CHOP的表达也是先降低再升高在第12天剧增。说明内质网应激相关基因的表达存在明显的阶段性,由此初步得出内质网应激可能参与了心肌的分化。乙酰化修饰相关基因Hadc2、4、6、7以及Cbp/P300的表达也具有明显的阶段性。3.4-PBA对心肌分化的影响Real-time PCR结果显示内质网应激相关基因的表达存在明显的阶段性,而体外心肌细胞的分化过程分为三个阶段,早期第(1-5)天、中期第(6-9)天、晚期第(10-12)天,所以在细胞分化的不同阶段加入内质网应激抑制剂4-PBA(1M),通过对拟胚体跳动数目的观察初步确定,4-PBA对心肌分化的影响存在三个阶段,早期促进,中期抑制,晚期促进。选取不同的时间点第1-2天、第3-5天、第1-5天加4-PBA收细胞提取RNA real-time PCR检测Nkx2.5与Gata4的表达,发现与对照组相比在第1-2天时Nkx2.5与Gata4的表达升高最为显著(p<0.01),在第6-7天、第8-9天、第6-9天、第10-11天、第11-12天、第10-12天加4-PBA收细胞提取RNA real-time PCR检测Myl2、Myl7及Tnnt2的表达,发现在第6-7天的抑制作用最为显著(p<0.01),在第11-12天的促进作用最为显著(p<0.01)。确定最佳加药时间。之后在第1-2天,第6-7天,第11-12天加4-PBA提取RNAreal-timePCR检测晚期基因Myl2和Myl7的表达,以及Western blotting检测晚期蛋白MF20的变化,进一步确定不同时间加4-PBA对心肌分化的影响,早期是促进、中期抑制、晚期又促进,存在三个阶段。4.4-PBA对心肌分化作用机制的研究结果(1)4-PBA对心肌分化的影响出现了三个阶段的变化。在不同时间段加入内质网应激的激动剂衣霉素(TM,0.025μg/ml)以及组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠(NaB,1M),RNAreal-timePCR检测不同时间段对心肌特异性基因的表达,发现衣霉素对心肌分化有明显的促进作用(p<0.05),但却没有阶段效应;丁酸钠对心肌分化的影响与4-PBA的效应是相似的。(2)在诱导分化的早期转染内质网应激标志基因pRK-ATF4,发现在早期对心肌特异性的转录因子Nkx2.5与Gata4的表达有提升作用,但是Gata4的表达没有显著性差异,可能跟转染效率有关。推测4-PBA对心肌分化的影响可能不是通过抑制内质网应激来实现的,但是内质网应激参与了心肌的分化。结论:4-苯基丁酸(4-PBA)对胚胎干细胞定向诱导为心肌细胞的影响是一个三阶段的过程,早期促进、中期抑制、晚期又促进。该影响初步确定不是通过抑制内质网应激,且加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠效应与4-PBA相似,但对于是否是通过乙酰化途径还需进一步地探究。