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本实验室前期工作中，从感染了青枯病的广藿香植株中分离得到了10多个青枯病病原菌株。本研究以对广藿香致病力较强的菌株Pa82为材料，通过菌落形态观察、致病性验证及16s rDNA序列测定，对菌株Pa82进行鉴定。在此基础上，利用Tn5转座子突变技术，对经鉴定的菌株进行插入突变，构建转座子插入突变体;通过致病性测定筛选低致病力突变株并对其进行防治广藿香青枯病的试验;再对低致病力突变株的Tn5转座子插入突变基因进行克隆。本研究旨在构建并筛选有潜在生防价值的工程菌株，为开发防治广藿香青枯病的植物疫苗奠定基础。
1.国内外研究评述
介绍了广藿香栽培技术及青枯病防治的相关研究现状;总结了不同寄主植物青枯病病原菌的种类;介绍了植物疫苗的种类及其应用现状;概述了Tn5转座子在鉴定病原菌致病基因和构建无致病力或弱致病力突变株中的应用。
2.广藿香青枯病菌Pa82的表型及分子鉴定
以前期获得的广藿香青枯病菌菌株Pa82为材料，观察菌落形态、测定致病性并PCR扩增其16s rDNA序列。结果表明，在TTC平板上培养的菌株Pa82，菌落形态平滑，呈红色带有白色菌圈，具有流动性。致病性回接实验结果表明，接种菌株Pa82的广藿香植株出现了明显的青枯病症状。16s rDNA序列分析表明，菌株Pa82与科萨克氏菌菌株Kosakonia sp. CCTCC M2018092基因相似度最大，达到99％以上，与桑树青枯病的病原菌株肠杆菌Enterobacter sp. ZJUPD6和香蕉青枯病的病原菌株科萨克氏菌Kosakonia radicincitans的相似度均为96％以上，与茄科青枯病的病原菌株劳尔氏菌Ralstonia solanacearum GMI1000的相似度为82％。通过菌落形态、致病性表型及其16s rDNA序列分析，将菌株Pa82鉴定并命名为科萨克氏菌Kosakonia sp. Pa82。
3.利用Tn5转座子插入突变技术构建菌株Pa82突变株的研究
利用Tn5转座子突变技术，对菌株Pa82进行插入突变，在含卡那霉素的选择培养基上筛选抗性克隆，分别提取抗性克隆的基因组DNA，用Kanr基因特异性引物P1/P2进行PCR扩增，计算阳性克隆率和转化效率。以转座子序列为基础，利用反向PCR技术，获取阳性克隆的转座子插入位点侧翼序列并测序。结果表明:合适的卡那霉素选择压力10μg/mL，阳性克隆率为80.52％，转化效率为3.52×104 cfu/μg。通过反向PCR扩增转座子插入位点侧翼序列及测序结果表明，成功构建了菌株Pa82的Tn5转座子插入突变株。
4.菌株Pa82低致病力突变株的筛选及其对广藿香青枯病的生物防治研究
对广藿香植株接种菌株Pa82的突变株，进行致病性测定，筛选低致病力突变株。在接种后第7d，接种野生菌株Pa82的广藿香植株的病情指数为81％，而接种突变株Pa82-15-3、Pa82-22-1、Pa82-87-1的病情指数范围在21％-32％，其中以突变株Pa82-22-1的病情指数最低。接种植株的致病性表型比较，无菌水处理的植株始终保持健康，接种野生菌株Pa82的植株出现明显的青枯病症状，大部分植株出现叶片下垂、萎蔫皱缩，茎秆弯曲的现象。与野生菌株相比，接种突变株的植株病情减弱。结果表明，成功筛选出3株致病性降低的突变株。
在生防试验中，以预接种低致病力突变株再接种野生菌株Pa82的植株为生防组，用水预处理再接种野生菌株Pa82的植株为阳性对照组，只用水处理的植株为阴性对照组，对广藿香植株进行生物防治试验，根据生防效果公式计算防效。结果表明，生防组防治效果排序:提前3d预接种＞提前2d预接种＞提前1d预接种。通过对菌株Pa82低致病力突变株进行预接种时间的筛选，表明预接种低致病力突变株3d后再接种野生菌株具有较好的防治效果。采用3d预接种时间对突变株Pa82-22-1和Pa82-87-1进行生物防治试验，它们对广藿香青枯病的防治效果分别为84.65％和72.04％。
5.菌株Pa82低致病力突变株Tn5转座子插入突变基因的克隆
以Tn5转座子为基础，对筛选出的低致病力突变株Pa82-22-1和Pa82-87-1基因组进行反向PCR扩增，获得转座子插入位点侧翼序列并进行测序;通过NCBI blast比对侧翼序列，找到了与插入突变基因同源的基因，根据同源基因设计引物对野生菌株Pa82进行PCR扩增，获取突变基因全长序列，将扩增后的目的基因与T载体相连并转化到大肠杆菌中，经菌落PCR及酶切鉴定获得阳性克隆。对阳性克隆进行目的基因序列的测定并进行NCBI blast比对，比对结果显示突变株Pa82-22-1和Pa82-87-1的转座子插入突变基因分别为Kotral基因和Korhs基因，与typeⅣ conjugative transfersystem protein TraL和typeⅣ secretion protein Rhs的编码基因分别具有99％和96％的相似性。
1.国内外研究评述
介绍了广藿香栽培技术及青枯病防治的相关研究现状;总结了不同寄主植物青枯病病原菌的种类;介绍了植物疫苗的种类及其应用现状;概述了Tn5转座子在鉴定病原菌致病基因和构建无致病力或弱致病力突变株中的应用。
2.广藿香青枯病菌Pa82的表型及分子鉴定
以前期获得的广藿香青枯病菌菌株Pa82为材料，观察菌落形态、测定致病性并PCR扩增其16s rDNA序列。结果表明，在TTC平板上培养的菌株Pa82，菌落形态平滑，呈红色带有白色菌圈，具有流动性。致病性回接实验结果表明，接种菌株Pa82的广藿香植株出现了明显的青枯病症状。16s rDNA序列分析表明，菌株Pa82与科萨克氏菌菌株Kosakonia sp. CCTCC M2018092基因相似度最大，达到99％以上，与桑树青枯病的病原菌株肠杆菌Enterobacter sp. ZJUPD6和香蕉青枯病的病原菌株科萨克氏菌Kosakonia radicincitans的相似度均为96％以上，与茄科青枯病的病原菌株劳尔氏菌Ralstonia solanacearum GMI1000的相似度为82％。通过菌落形态、致病性表型及其16s rDNA序列分析，将菌株Pa82鉴定并命名为科萨克氏菌Kosakonia sp. Pa82。
3.利用Tn5转座子插入突变技术构建菌株Pa82突变株的研究
利用Tn5转座子突变技术，对菌株Pa82进行插入突变，在含卡那霉素的选择培养基上筛选抗性克隆，分别提取抗性克隆的基因组DNA，用Kanr基因特异性引物P1/P2进行PCR扩增，计算阳性克隆率和转化效率。以转座子序列为基础，利用反向PCR技术，获取阳性克隆的转座子插入位点侧翼序列并测序。结果表明:合适的卡那霉素选择压力10μg/mL，阳性克隆率为80.52％，转化效率为3.52×104 cfu/μg。通过反向PCR扩增转座子插入位点侧翼序列及测序结果表明，成功构建了菌株Pa82的Tn5转座子插入突变株。
4.菌株Pa82低致病力突变株的筛选及其对广藿香青枯病的生物防治研究
对广藿香植株接种菌株Pa82的突变株，进行致病性测定，筛选低致病力突变株。在接种后第7d，接种野生菌株Pa82的广藿香植株的病情指数为81％，而接种突变株Pa82-15-3、Pa82-22-1、Pa82-87-1的病情指数范围在21％-32％，其中以突变株Pa82-22-1的病情指数最低。接种植株的致病性表型比较，无菌水处理的植株始终保持健康，接种野生菌株Pa82的植株出现明显的青枯病症状，大部分植株出现叶片下垂、萎蔫皱缩，茎秆弯曲的现象。与野生菌株相比，接种突变株的植株病情减弱。结果表明，成功筛选出3株致病性降低的突变株。
在生防试验中，以预接种低致病力突变株再接种野生菌株Pa82的植株为生防组，用水预处理再接种野生菌株Pa82的植株为阳性对照组，只用水处理的植株为阴性对照组，对广藿香植株进行生物防治试验，根据生防效果公式计算防效。结果表明，生防组防治效果排序:提前3d预接种＞提前2d预接种＞提前1d预接种。通过对菌株Pa82低致病力突变株进行预接种时间的筛选，表明预接种低致病力突变株3d后再接种野生菌株具有较好的防治效果。采用3d预接种时间对突变株Pa82-22-1和Pa82-87-1进行生物防治试验，它们对广藿香青枯病的防治效果分别为84.65％和72.04％。
5.菌株Pa82低致病力突变株Tn5转座子插入突变基因的克隆
以Tn5转座子为基础，对筛选出的低致病力突变株Pa82-22-1和Pa82-87-1基因组进行反向PCR扩增，获得转座子插入位点侧翼序列并进行测序;通过NCBI blast比对侧翼序列，找到了与插入突变基因同源的基因，根据同源基因设计引物对野生菌株Pa82进行PCR扩增，获取突变基因全长序列，将扩增后的目的基因与T载体相连并转化到大肠杆菌中，经菌落PCR及酶切鉴定获得阳性克隆。对阳性克隆进行目的基因序列的测定并进行NCBI blast比对，比对结果显示突变株Pa82-22-1和Pa82-87-1的转座子插入突变基因分别为Kotral基因和Korhs基因，与typeⅣ conjugative transfersystem protein TraL和typeⅣ secretion protein Rhs的编码基因分别具有99％和96％的相似性。