本课题组在前期工作中,开展了 Tn5转座子对广藿香青枯病菌的插入诱变研究。本文以前期获得的广藿香青枯菌菌株PRS-84的16个突变株为材料,分别进行继代培养,每隔5代,观察突变株继代过程中菌落形态的变化,并对突变株Kanr基因进行PCR验证,直至100代;利用Southern blot技术对继代100代的突变株进行鉴定;利用反向PCR技术对继代100代突变株Tn5转座子插入位点的侧翼序列进行扩增及序列测定。在此基础上,对继代100代突变株(PRS-84-6-13和PRS-84-10-69)进行生物学特性研究,综合考察广藿香青枯病菌Tn5转座子插入突变株的遗传稳定性及生物学特性的变化,为筛选遗传稳定的生防菌株奠定基础。1.国内外评述查阅了与本研究相关的国内外文献,从种质资源、栽培育种和病害防治三个方面论述了广藿香的研究现状;从青枯病病原菌的鉴定、青枯菌的致病机制及青枯病的防治方法概述了青枯病的研究现状;从转座子的结构及插入机制、转座子插入位点的鉴定方法、转座子插入的遗传稳定性以及转座子插入诱变的应用方面综述Tn5转座子的相关研究现状。2.继代突变株的分子鉴定以广藿香青枯菌菌株PRS-84的16个突变株为材料,分别进行继代培养,每隔5代对突变株Kanr基因进行PCR验证,直至100代;利用Southern blot分析技术对继代100代的突变株进行分子鉴定。结果表明:突变株在继代过程中,均能扩增出kan’基因的特异性条带;原代和继代100代的突变株均在同一位置出现一条杂交带,说明转座子在这几个突变株基因组中均为单插入,转座子基因在突变株基因组中稳定存在。3.继代突变株,Tn5转座子插入位点的序列测定及分析利用反向PCR技术获取继代100代突变株Tn5转座子插入位点的侧翼序列,并进行序列测定;通过DNASTAR软件,对继代前后突变株的反向序列进行匹配度分析;结果表明:转座子在继代前后突变株基因组中的插入位置没有发生变化一且插入位点侧翼序列也没有发生改变。4.继代突变株的生物学特性分析以16个突变株为材料,在NA培养摇及含有那霉素的选择培养基上分别继代培养至100代,观察继代过程中菌落形态的变化;并绘制继代突变株PRS-84-6-13和PRS-84-10-69的生长曲线。结果表明:大多数突变株继代前后菌落形态变化不大,有5个突变株继代后菌落形态行一定的变化,及现在菌落大小、颜色深浅、白边宽度及流动性等方面的一些差异。各菌株的生长趋势相似,均呈“S”型;继代100代突变株PRS-84-10-69的生长曲线与原代突变株相比发生了较大的变化,表现在调整期时间延长2h,对数期生长速率明显减小,平稳期的菌液OD600值降低;继代培养对突变株PRS-84-6-13的生长曲线几乎没有影响。