近年来受到人口流动性增大、人口老龄化、过分依赖卡介苗、人类免疫缺陷病毒(HIV)与结核分枝杆菌共感染、毒品及女性吸烟等诸多因素的影响，结核病死灰复燃，全球呈大回升之势。估计全球已有5000万人受耐药结核分枝杆菌的感染。我国是疫情和耐多药率高的国家，2000年全国流行病学调查(流调)显示初始耐药率为18.6%，初始耐多药(MDR，同时耐HK)率为7.6%。结核分枝杆菌耐药性的产生和传播更加剧了结核病的流行。利福平(RFP)作为抗结核一线药物，结核分枝杆菌对其耐药发生率高达90%以上，其耐药性产生是由于其作用靶分子RNA多聚酶的β亚单位的编码基因rpoB突变所致。这类突变属于单碱基错义突变，主要发生在核糖核酸多聚酶的β亚基（rpoB基因），而且突变集中在约81个碱基长度的DNA区段内，故通过PCR-SSCP技术可将97%以上的利福平耐药株快速鉴别出来。PCR-SSCP技术对利福平耐药性的检测具有快速、操作简便、易行的特点，并使应用传统耐药测定方法耗时1～2个月缩短到2天内即可完成。因此PCR-SSCP可快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变，适用于结核分枝杆菌临床分离株的快速检测。由于一般临床结核耐药检测需4～6周，而利用分子生物学方法检测rpoB基因突变仅需时1～2天，并能较准确地反映对利福平的耐药<WP=37>性。因此，研制开发快速诊断rpoB基因突变检测试剂对快速检测对利福平的耐药性有重要价值。传统耐药性检测，是依靠培养法进行药物敏感性测定，但结核分枝杆菌生长极缓慢，药敏试验耗时长，需3～4周以上。用PCR产物的单链构象多态性分析(PCR-SSCP)，能显示结核分枝杆菌抗药性突变型的带谱，但准确率相对较低。PCR-SSCP是近年来发展起来的一种检测基因突变的技术，尤其是对单碱基置换点突变检测和筛选具有可靠简捷高效的特点。随着分子生物学的不断发展， PCR-SSCP技术进一步完善、改进，其更将广泛用于临床。本实验包括实验室部分和临床标本部分。在实验室里，我们对购得的结核分枝杆菌国际标准株、结核分枝杆菌耐利福平株，非结核分枝杆菌（鸟型、堪萨斯）及作为实验对照的细菌菌株（金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠杆菌、肺炎链球菌）均采取煮沸法提取细菌DNA；在临床，我们采集48例临床诊断为结核病的患者，采集TritonX-100裂解煮沸法提取标本的DNA。以上述DNA为模板，应用上游、下游引物，进行多重PCR扩增。扩增反应体系为50μl，其中含10×多聚酶缓冲液5μl，dNTP各200mmol/L，引物浓度为0.8pmol/μL，模板DNA2μl，TaqDNA多聚酶2.5U，余体积用ddH2O补齐。震荡混匀后加入一滴石蜡油覆盖于反应体积表面。反应参数如下：95℃预变性5分钟，持续94℃变性1分钟，61℃复性1分钟，72℃延伸1分钟，共循环30次，最后一步72℃延伸10分钟。其扩增产物为258bp.对获得258bp 扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳—凝胶硝酸银染色（SSCP）。<WP=38>结果判定：双链PCR产物经变性后形成两条单链，经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后呈现两条单链带。若所呈现的单链位置与标准株单链位置不同，称为泳动变位，即可判定存在基因突变。实验全过程可在2天内完成。结核分枝杆菌菌株均扩得一258bp的特异性条带，但其他6种细菌菌株rpoB基因PCR扩增的结果均为阴性。结核分枝杆菌国际标准株及耐利福平国际标准株与临床利福平耐药株及利福平敏感株均扩得一258bp的特异性条带，并获得满意的SSCP的图谱。痰标本DNA产物扩增结果较菌株扩增结果在相同条件下弱一些。以结核分枝杆菌标准株H37RV为对照，48株结核临床分离株中11株RFP敏感株中10株SSCP带谱均与对照相同，37株RFP耐药株中有3株带谱与对照相同，另34株SSCP带谱与对照有不同程度的差异。PCR-SSCP方法检测RFP耐药结核菌的敏感性为91.90%，特异性为90.90%。设计针对突变高发区的特异性引物， 通过聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)检测结核分枝杆菌rpoB基因是否存在是一种简便、快速鉴定突变的有效方法，在48株结核分枝杆菌临床分离株的检测中，显示与药敏结果符合91.9%，与有关文献报道相符。而且可直接检测痰涂片阳性标本和L-J培养阳性中的RFP耐药菌株。PCR-SSCP技术虽然不能确定基因突变的部位、性质和数目，但却具有技术条件较为成熟、简单、快捷、准确和检出率高等优点。PCR-SSCP过程可在1～2天内即可完成，具有简便、快速、特异等优点，达到指导临床<WP=39>用药的目的，有利于病人尽早治疗，可减轻患者的痛苦及经济负担，并可以满足临床快速进行结核分枝杆菌耐药性检测的需要。PCR-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)有临床应用价值，其技术随分子生物学的发展，会越来越完善，更适用于临床快速检测耐利福平结核分枝杆菌。