现阶段国内畜牧业发展体系下,虽然集约化养殖逐步取代传统的养殖模式,最大限度的避免了畜禽养殖过程中自然因素的影响,但畜禽的非连续性的冷暴露依然无法避免,因此导致的慢性冷应激反应在畜禽养殖过程中仍时有发生。而海马体作为各类细胞因子、应激激素作用的首要靶点,当慢性冷应激发生后会遭受到怎么样的影响呢?其中又存在着怎样复杂的调控机制呢?为此深入研究慢性冷应激对小鼠海马体结构及功能影响,对保障畜牧业健康、可持续性发展、提高畜禽养殖福利具有重要意义。为明确慢性冷暴露对小鼠海马体功能及结构的影响,本研究首先通过对不同性别C57BL/6小鼠施加3小时/天,为期7天的非连续性冷刺激以构建慢性冷应激小鼠模型;期间对各组小鼠血清中糖皮质激素含量进行连续监测,并于辅以血气分析以评估慢性冷应激模型是否构建成功。结果显示与对照组相比在模型组小鼠冷暴露的1、3、5、7天血清中糖皮质激素含量均发生极显著增加(P<0.001);并且冷暴露7天后小鼠血气分析结果中pH等均发生显著变化(P<0.01),综合两项试验结果确定慢性冷应激小鼠模型构建成功。基于上述结果,对各处理组小鼠进行安乐死并对海马及全脑组织进行样品采集,通过免疫印迹、质谱分析;脑切片免疫组化、尼氏染色等方法对海马体组织内环境稳态及神经递质代谢产物进行综合检测,从而明确慢性冷暴露对海马体结构及海马神经元功能的影响。结果显示,与对照组相比,应激蛋白以及多项细胞因子蛋白表达量均显著上调(P<0.01)。与此同时,小鼠脑切片结果显示海马组织CA1、CA3两个功能区内活化的小胶质细胞数极显著增加(P<0.001);海马神经元表达量降低(P<0.05)、神经元内尼氏小体数量极显著减少(P<0.001);各类神经递质如:血清素、伽马氨基丁酸、乙酰胆碱、谷氨酸代谢产物具有显著性差异(P<0.05)。并且,冷应激模型组中各项结果不仅在与对照组的统计分析中展现出统计学差异,在模型组内,不同性别小鼠之间的数据统计分析结果也呈现出显著差异变化。与此同时,研究发现,海马组织内糖皮质激素(Glucocorticoid,GCs)含量发生极显著上调(P<0.001),因此推测GCs可能介导了海马组织CA1、CA3功能区内小胶质细胞活化、神经元数量减少造成神经递质代谢异常等现象。为验证GCs介导小胶质细胞活化的试验假设,在体外试验部分,使用不同浓度的GCs(CORT)对小胶质细胞系BV2细胞进行刺激,选取适当浓度以构建BV2细胞的GCs过量模型,通过免疫印迹、免疫荧光、双荧光素酶报告基因测定、免疫共沉淀等方法对GCs暴露下小胶质细胞活化的相关机制进行系统检测。体外试验结果显示,200μΜ浓度CORT可通过抑制BV2细胞内沉默信息调节因子2相关酶1(Sirtuin1,SIRT1)的表达量及酶活(P<0.05),上调胞内组蛋白H3与p65亚基的乙酰化修饰,促进转录因子NF-κB与组蛋白的互作关系,介导小胶质细胞的活化,并主动释放乙酰化的高迁移率蛋白1(High-mobility group box-1,HMGB1)及IL-1β。综合GCs处理下BV2细胞活化进程的各项结果可以确定,200μΜ浓度CORT可以通过上调胞内乙酰化修饰介导小胶质细胞活化并主动释放乙酰化的HMGB1。在明确GCs可以诱导小胶质细胞活化后,为进一步探究GCs对海马神经元的影响,体外试验继续使用不同浓度的CORT构建HT22细胞的GCs过量模型,并使用GR抑制剂美服培酮(Mifepristone,RU486)对细胞进行预处理通过免疫印迹、免疫荧光、双荧光素酶报告基因测定、免疫共沉淀、透射电镜扫描等方法对GCs暴露下HT22细胞的死亡机制进行系统检测,以验证体内试验提出的科学假设。结果显示400μΜ浓度CORT处理HT22细胞3小时后,HT22细胞内线粒体功能受损、结构完整性消失;胞内Nrf2移位入核加强与乙酰化的H3结合,促进了下游SOD1、HO-1在内的靶基因转录,细胞内大自噬、线粒体自噬、内源性凋亡等细胞程序性死亡现象发生。而在使用RU486预处理之后再次使用400μΜ浓度CORT对HT22细胞进行处理后发现,胞内大自噬、线粒体自噬、内源性凋亡等现象均发生的更为剧烈。由此表明,过量的CORT可以不通过与其受体作用而直接对线粒体造成损伤,介导细胞凋亡、大自噬及线粒体自噬现象的发生,促进HT22细胞的程序性死亡。体外试验结果已充分证明GCs可以诱发BV2细胞活化并介导HT22细胞程序性死亡,为了对体外试验内容进行验证和补充,冷应激小鼠模型中海马神经元的死亡机制被检测。结果证明,冷暴露可以通过上调小鼠海马组织内乙酰化修饰水平介导小胶质细胞活化;并可通过影响线粒体功能经由自噬、凋亡途径导致海马神经元程序性死亡。综合以上结果表明,冷暴露诱导过量的GCs上行穿过小鼠血脑屏障,通过影响SIRT1的表达量及去乙酰化活性介导小胶质细胞的活化间接导致海马神经元凋亡;与此同时过量的GCs也可以通过破坏海马神经元线粒体功能及结构完整性经由细胞自噬和凋亡途径诱导神经元程序性死亡。而由于小胶质细胞对GCs的敏感性要显著高于海马神经元,因此推测,冷暴露介导小鼠海马组织内小胶质细胞活化进程要先于神经元程序性死亡。并且由于GCs在雌雄小鼠中枢神经系统代谢速率不同,导致冷暴露对小鼠海马组织功能及完整性的影响具有性别差异。