论文部分内容阅读
根据GenBank上的甘蔗ACO的cDNA序列(AY521566)，设计了特异性引物。以经激素处理的甘蔗ROC20幼叶总RNA为模板，利用RT-PCR扩增得到全长969bp甘蔗ACO cDNA的ORF。序列分析表明：ACO cDNA ORF与AY521566的核苷酸序列同源性为98.6％，氨基酸序列同源性为97.5％。将得到的甘蔗ACO、水稻OS-ACO(CAA59749)及番茄LE-ACO1(PO5116)与已知结构域的异青霉素N-合成酶(Isopenicillin N synthase IPNS PO5326)的氨基酸序列进行比较发现，在三个保守结构域(Box1、Box2、Box3)存在3个保守的组氨酸H43、H183、H240，并分析了三个保守结构域的氨基酸序列同源性。以甘蔗ROC20幼叶总DNA为模板，PCR扩增得到了全长1075bp的甘蔗ACO基因组的DNA序列。通过cDNA和DNA序列的比对，发现甘蔗ACO基因组DNA由1个103bp的内含子和2个总长972bp外显子组成。2个外显子共编码324氨基酸；内含子的AT含量达到61％且含有较多的重复序列。通过正义表达中间载体pJUSACO和反义表达中间载体pJUantisaco，利用pCAMBIA3301构建了甘蔗ACO cDNA的正义表达载体pCBUSACO和反义植物表达载体pCBUantisaco，用于甘蔗的遗传转化以进一步研究甘蔗ACO基因调控乙烯生物合成的机制。 利用得到的甘蔗ACO cDNA构建了原核表达载体pET30a-Sgaco，转化E.coli BL21(DE3)plysS获得高效表达，产生分子量为40KD的重组蛋白，