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目的:1.建立小鼠非酒精性脂肪肝肝炎合并肝纤维化模型;2.运用该模型评价中药复方祛湿化瘀方对非酒精性脂肪肝炎(NASH)合并肝纤维化的药效;3.在证实祛湿化瘀方对NASH合并肝纤维化疗效显著的基础上,进一步运用转录组学分析该方可能的作用机制。方法:1.运用高反式脂肪酸饲料饮食复合高糖饮水(HFHC)诱导小鼠NASH合并肝纤维化动物模型,并分别在16、20和24周末对该模型进行生化或病理动态评价,确定制备NASH合并肝纤维化模型合适的造模周期。2.运用上述合适造模周期的小鼠非酒精性脂肪肝炎合并纤维化模型,将实验小鼠随机均分为:正常组、模型组、祛湿化瘀方治疗组、扶正化瘀方对照组、奥贝胆酸对照组。各用药组给药四周后取材,主要观察:肝组织甘油三酯(TG)含量、肝组织羟脯胺酸(HYP)含量、空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、肝功能(血清ALT、AST活性)、肝组织病理(HE、油红O染色、天狼星红染色)、肝纤维化相关指标(Col-1、Col-4、α-SMA和TGF-β蛋白和mRNA水平的表达),评价祛湿化瘀方治疗实验性非酒精性脂肪肝炎合并肝纤维化的药效。3.运用转录组基因芯片技术对上述各组小鼠肝组织进行转录组表达谱检测,分析比较正常组、模型组和祛湿化瘀方组各组间差异表达基因,并分析差异基因的功能、涉及的信号通路等。结果:1.高反式脂肪酸饲料饮食复合高糖饮水喂养小鼠16周末,与正常小鼠相比,模型组小鼠肝脏TG、HYP含量显著升高;血清ALT、AST活性显著升高;FBG、FSI和HOMA-IR显著升高;肝组织HE染色显示肝细胞脂肪变性明显,出现炎细胞浸润,部分肝细胞出现气球样变;天狼猩红染色显示部分小鼠(60%)开始出现肝腺泡三区胶原纤维沉积。20周末HE染色显示模型组小鼠肝组织出现明显大泡性脂肪样变并与小泡性脂肪样变,炎细胞浸润多见;天狼猩红染色显示肝组织出现呈星芒样分布的窦周纤维化,纤维化分期均为F1-2期。24周末HE染色显示模型小鼠肝组织已出现重度大泡性与小泡性脂肪样变(范围66%-99%之间),伴显著地肝细胞气球样变性及小叶内炎性灶,天狼猩红染色显示所有小鼠肝组织窦周纤维化明显,呈鸡笼样纤维化改变,部分有桥接形成,纤维化分期大多为F2-F3期。2.运用上述造模方法对小鼠造模24周后,给予祛湿化瘀方灌胃治疗4周,药效学结果显示:与模型组相比,祛湿化瘀方组小鼠肝脏TG、HYP含量显著降低;血清ALT、AST活性显著下降;FBG、FSI和HOMA-IR显著降低。HE染色显示祛湿化瘀方组小鼠肝组织脂肪空泡显著减少,炎细胞浸润程度显著降低,炎细胞数目显著减少;天狼猩红染色显示胶原纤维显著减少,胶原纤维疏松且有断裂消失痕迹,75%纤维化分期为F0-F1期。祛湿化瘀方小鼠肝组织Col-1、Col-4、α-SMA和TGF-β蛋白及mRNA水平较模型组均显著下降。3.肝组织转录组芯片结果:祛湿化瘀方组与模型组两组间差异基因中差异倍数Log2FC绝对值大于2且P<0.05的差异基因有135个,上调基因84个(包括 Dusp9、Cyp2b13 和 Gdf3等),下调基因 51 个(包括 Hspa1a、Timd4、Cxc113等),这135个差异基因涉及21条信号通路(包括细胞外基质受体相互作用通路、细胞黏附分子通路、视黄醇代谢通路、胆汁分泌通路和MAPK信号通路等)。模型组与正常组、祛湿化瘀方组与模型组相比差异趋势相反,Log2FC绝对值大于2且有统计学差异(P<0.05)的基因共33个(包括Rgs4、Ighg1、Elmol、Gcnt1、Prune2、Msx1、Cdkn2b 和 Scand1 等),这 33 个差异基因涉及 49 条KEGG通路,其中有显著统计学差异的通路(P<0.05)(包括FoxO信号通路、TGFβ信号通路、NF-κB信号通路和PI3K-Akt信号通路等)18条。结论:1.高反式脂肪酸饲料饮食复合高糖饮水喂养小鼠24周,可以成功诱导出具有合并肥胖、高胰岛素血症的符合人类发病规律的非酒精性脂肪肝炎合并肝纤维化的小鼠模型。2.祛湿化瘀方可显著减轻NASH合并肝纤维化小鼠肝脏脂肪变性和炎症、改善肝纤维化和胰岛素抵抗。3.祛湿化瘀方可能通过免疫、代谢、癌症信号通路相关基因和信号通路(细胞外基质受体相互作用、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路等)来治疗NASH合并肝纤维化。