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研究背景肺癌已成为全世界范围内最常见的恶性肿瘤,具有高发病率、高转移率和高死亡率的特点,严重威胁着人类的生命健康。治疗肺癌的传统方法有手术、化疗和放疗,但因多数病人在发现病情时已处于中晚期,出现远处病灶转移等症状,所以经传统治疗方法治疗的晚期肺癌患者,其长期存活率仍然很低。因此,寻找更安全更有效治疗肺癌的新方法和抗肿瘤活性物显得尤为迫切。弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性胞内寄生原虫,可致人畜共患病,危害人类健康。研究弓形虫与寄生宿主间的关系,一直是相关学者研究的热点。值得注意的是,有研究发现,弓形虫感染对某些肿瘤细胞具有增殖抑制作用,可诱导肿瘤细胞发生凋亡;另有研究发现,弓形虫侵染结肠癌细胞后,会引起细胞周期阻滞进而抑制肿瘤细胞的增殖。除了弓形虫感染可作用一些肿瘤细胞外,有学者用弓形虫的培养上清液孵育肿瘤细胞,结果表明,弓形虫培养上清液能够抑制细胞的增殖,并诱导细胞发生凋亡。越来越多的研究表明,弓形虫培养上清液对多种肿瘤细胞发挥抗肿瘤作用,但作用机制尚未明确。在前期研究中,我们从弓形虫速殖子的培养上清液中分离、纯化并鉴定了外泌体(exosomes),我们推测具有抗肿瘤效应的蛋白或分子可能包裹于弓形虫exosomes之中,从而发挥抗肿瘤作用。研究目的本研究以非小细胞肺癌A549细胞系和H1299细胞系为研究对象,在体外分别将其与弓形虫exosomes共同培养,检测弓形虫exosomes对非小细胞肺癌细胞的增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响,在细胞、分子水平上探究其可能的作用机制,为弓形虫exosomes用于肺癌治疗提供实验依据。方法:1.采用CCK-8法检测弓形虫exosomes对A549细胞和H1299细胞的增殖抑制作用;2.通过流式细胞术观察弓形虫exosomes作用A549细胞和H1299细胞后对细胞周期分布的影响;3.采用Annexin V-FITC/PI双染法检测弓形虫exosomes对A549细胞和H1299细胞凋亡的作用;4.通过流式细胞术检测弓形虫exosomes对A549细胞和H1299细胞Caspase-3活性的作用;5.通过荧光显微镜观察弓形虫exosomes作用H1299细胞后对细胞晚期凋亡的影响;6.通过流式细胞术检测弓形虫exosomes作用A549细胞和H1299细胞后对细胞线粒体膜电位的影响;7.通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测周期相关基因Cyclin B1、Cyclin D1和凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA的表达;8.采用Western blot法检测A549细胞和H1299细胞中周期相关蛋白Cyclin B1和 Cyclin D1,凋亡相关蛋白 Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2 以及 p-ERK、ERK、p-P38、P38 蛋白的表达。结果:1.CCK-8实验结果显示:弓形虫exosomes对A549和H1299细胞生长有抑制作用,在一定作用时间和作用浓度内,H1299细胞存活率随时间的延长而下降,呈时间依赖性;A549细胞的存活率在exosomes作用24h后最低(p<0.0001);2.流式实验结果显示:弓形虫exosomes作用A549细胞24h后,处于G0/G1期细胞的比例减少,G2/M期细胞的比例却明显增加(p<0.001);而H1299细胞处于G0/G1期细胞的比例增加(p<0.01),G2/M期细胞的比例却减少。3.流式细胞术检测肺癌细胞凋亡结果显示:弓形虫exosomes处理A549和H1299细胞后,凋亡细胞所占比例均增大(p<0.0001);4.Caspase-3活细胞活性检测实验显示:弓形虫exosomes处理A549和H1299细胞后,活细胞Caspase-3活性明显增大,差异均具有统计学意义(p<0.001);5.TUNEL实验结果显示:弓形虫exosomes刺激H1299细胞后,与对照组相比,凋亡晚期细胞占比明显增加;6.流式实验结果显示:弓形虫exosomes干预A549和H1299细胞后,实验组细胞绿色荧光占比增加,表明弓形虫exosomes下降了肺癌细胞线粒体的膜电位(p<0.001);7.qRT-RCR结果显示:在A549细胞中,弓形虫exosomes可显著降低A549细胞中周期相关基因Cyclin Bl的表达(p<0.001),可升高促凋亡基因Caspase-3的表达(p<0.05),下调抗凋亡基因Bcl-2的表达(p<0.001),并上调促凋亡基因Bax的表达(p<0.05);在H1299细胞中,弓形虫exosomes可显著降低H1299细胞中周期相关基因Cyclin D1的表达(p<0.01),可升高促凋亡基因Caspase-3的表达(p<0.01),下调抗凋亡基因Bcl-2的表达(p<0.01),并上调促凋亡基因Bax的表达(p<0.0001);8.Western blot结果显示:在A549细胞中,弓形虫exosomes可显著降低A549细胞中周期相关蛋白Cyclin B1的表达(p<0.01),可升高促凋亡基因Caspase-3的表达(p<0.01),下调抗凋亡基因Bcl-2的表达(p<0.01),上调促凋亡基因Bax的表达(p<0.01),上调p-P38的表达(p<0.01),下调p-ERK的表达(p<0.05);在H1299细胞中,弓形虫exosomes可显著降低H1299细胞中周期相关蛋白Cyclin Dl的表达(p<0.01),可升高促凋亡基因Caspase-3的表达(p<0.01),下调抗凋亡基因Bcl-2的表达(p<0.05),并上调促凋亡基因Bax的表达(p<0.01),上调p-P38的表达(p<0.01),下调p-ERK的表达(p<0.05)。结论:1.弓形虫exosomes对非小细胞肺癌A549和H1299细胞具有抑制增殖并阻滞细胞周期的作用;2.弓形虫exosomes可通过Caspase-3剪切形式诱导非小细胞肺癌A549细胞和H1299细胞发生凋亡;3.弓形虫exosomes使非小细胞肺癌A549细胞和H1299细胞的线粒体膜电位下降,这可能作为上游信号分子启动了细胞凋亡程序;4.弓形虫exosomes可能通过影响MAPK信号通路和线粒体凋亡通路抑制非小细胞肺癌细胞的增殖并诱导其发生凋亡。