人工诱变选育肌苷高产菌株

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肌苷可用来合成食品助鲜剂5`-肌苷酸、可用于治疗血小板减少、白细胞减少症、治疗急性肝炎和肝硬化、慢性肝炎等多种疾病,是一种非常重要的核苷类药物。目前肌苷是通过发酵进行生产的,是典型的代谢控制发酵,因此优良的菌株是提高产量的关键。以实验室保存的肌苷菌株BacillussubtilisHSD1206为出发菌株,分别通过自然选育法、紫外线诱变法、DES诱变及紫外线-硫酸二乙酯复合诱变处理,获得新的突变菌株并从中筛选高产菌株。(1)采用梯度平板法选育磺胺胍抗性菌株,经过多轮次的筛选得到了磺胺胍抗性明显提高的菌株,其抗性由原来出发菌株50mg/L提高到300mg/L;通过摇瓶发酵进行初筛和复筛,获得产苷能力提高的菌株,其中菌株K25产苷水平达到12.13g/L,比出发菌株产量提高了27.95%,其磺胺胍抗性和产量性状的遗传表现稳定。(2)通过UV、DES、UV+DES等诱变处理方法,在选择培养基上筛选变异菌株,再从变异菌株中选高产菌株。结果表明UV或DES单因子诱变处理获得新的突变型比较困难,但对于恢复菌种原有典型遗传性状和提高产量仍然有作用,例如UV或DES单因子处理后,菌株硫胺素的缺陷性状得到一定的恢复,获得的菌株产量有所提高;而用UV+DES复合处理可以获得新的缺陷型—组氨酸缺陷型,产量也得到了较大幅度的提高。(3)确定了最佳的紫外线诱变方法:20W紫外灯30cm处照射60s。紫外线诱变通过初筛和复筛得到了高产菌株UV23,传代6次菌株产苷能力依然稳定,达到了19.96g/L,比出发菌株产量提高了17.62%。(4)确定了最佳的DES诱变方法:1%的DES处理10min。DES诱变通过初筛和复筛得到了高产菌株D4,传代6次菌株产苷能力依然稳定,达到了19.47g/L,比出发菌株产量提高了22.53%。(5)确定了最佳的紫外线-DES诱变方法:先紫外照射50s,然后1%DES处理8min。通过紫外线-DES诱变得到了一株具有新的营养缺陷型菌株DU65,经鉴定该菌株为腺嘌呤、硫胺素、组氨酸三重缺陷型菌株。该菌株在未经优化的培养基上具有产苷能力,且比出发菌株有所提高。(6)经过碳源、氮源和生长因子和单因子试验和正交试验,DU65菌株的最佳发酵培养基为:葡萄糖18%,酵母粉17g/L,玉米浆15g/L,蛋白胨6g/L,豆粕水解液9g/L,腺嘌呤150mg/L,硫胺素5.4mg/L,组氨酸75mg/L,磷酸二氢钾30g/L,硫酸镁0.1g/L,硫酸锰0.1g/L,消泡剂1g/L。DU65菌株在该培养基摇瓶发酵产达苷产量为22.95g/L,比出发菌株提高了31.97%。(7)将通过诱变筛选得到的3株高产菌株进行50L发酵罐放大实验,结果表明在反应器水平上3株高产菌株依然表现增产,其中具有新型营养缺陷型的菌株DU65产苷速度快,发酵时间短,最终产苷37.43g/L,比出发菌株增产了17.82%。
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