论文部分内容阅读
皮肤附属物是指由表皮或真皮衍化而成的结构,对脊椎动物的生存有重要作用。皮肤附属物不仅被用于构建生物医学相关的发育生物学模型,且由于其进化意义一直受到研究者的广泛关注。鳞片作为鱼类皮肤附属物之一,对鱼体起到十分重要的作用。鱼类鳞片和其他动物的皮肤附属物在起源上有相似之处,其分子调控机制的研究对其他动物中形态万千的皮肤附属物的研究也有重要借鉴意义。团头鲂(Megalobrama amblycephala)作为我国重要的淡水养殖鱼类,具有重要的经济价值。对于其鳞片发育模式、组织形态过程及分子调控机制的研究还未见报道。本研究以团头鲂为研究对象,对其鳞片的发生发育过程,关键基因的筛选及功能进行了相关研究,主要研究结果如下:1、团头鲂体表鳞片覆盖模式、鳞片发育的组织变化过程和组织结构研究。结合形态学和组织学方法,利用茜素红染色和钙黄绿素染色以及电子显微技术对团头鲂的鳞片发育过程进行了系统的观察研究。结果显示,团头鲂鳞片属于硬鳞中的圆鳞,微观结构观察显示其结构分为限制层、外部蛋白层和内部蛋白层。团头鲂鳞片的起始位置位于鳃盖后缘侧线处,随着鱼体的不断生长,在尾柄侧线处和胸鳍基部依次出现鳞片。从开始出现鳞片到覆盖完全,其发育共经历了5个阶段。鳞片是由鱼类皮肤表皮和真皮间的细胞不断分化而来,组织学过程主要包括:形态发生早期、形态发生晚期、分化早期、分化晚期和折叠期。团头鲂的生长对鳞片的发育存在重要影响,其中鳞片发育与鱼体体长的相关性高于日龄。2、筛选出与团头鲂鳞片发育相关的调控基因。通过对团头鲂鳞片覆盖前后两个阶段鳞片起始部位的皮肤和鳞片组织的转录组进行测序分析,筛选到DEGs有9802个。并对差异基因进行GO和KEGG功能富集分析,富集到的GO最多的条目是:细胞进程、生物调节和代谢过程;共有5452个DEGs富集到KEGG Pathway中,共分为6大支,其中基因数目最多的类别是环境信息处理类别下的信号转导(Signal transduction)有1632个DEGs。筛选出与团头鲂鳞片发育相关的基因有86个,主要涉及整联蛋白家族成员(ITGA3、ITGA10、ITGA5、ITGA4、ITGB4、ITGB6、ITGBX、ITGB3、ITGAV);FGF信号传导家族(FGF20、FGF12、FGF16、FGFR1a);丝裂原活化蛋白激酶家族(MAP4K2、MAP4K3、MAP3K2、MAP3K13、MAP2K7、MAP3K12、MAP3K8)。3、为进一步探究候选基因在团头鲂鳞片发育过程中的作用,对候选基因(EDA、EDAR、SHHa、BMP2b、FGFR1a、SHHb、FGFR1b)进行成鱼各组织的表达模式分析,结果显示在团头鲂皮肤组织中显著高表达的基因有EDA、SHHb,极显著高表达的基因有EDAR、FGFR1b。对EDA基因进化分析显示,团头鲂EDA基因和斑马鱼EDA基因聚为一支,具有高度同源性。利用基因编辑技术初步构建了斑马鱼EDA基因的CRISPR/Cas9敲除系统,F0代测序结果显示敲除有效,为下一步突变体的筛选奠定基础。观察F0代个别个体,与WT相比,突变个体在其尾部椎骨的髓棘和脉棘末端出现不同程度的弯曲。随着鱼体的进一步生长,其躯干部椎骨的肋骨和髓棘也出现不同程度的形变,鳞片也出现部分缺失。