研究背景:　　 肝纤维化是指肝脏内弥漫性细胞外基质（特别是胶原）过度沉积所致的一种常见病理变化。它不是一个独立的疾病，而是多种慢性肝脏疾病导致肝脏不断损伤和修复的过程，肝纤维化可以进一步发展为肝硬化甚至肝癌。目前，肝纤维化和肝硬化已成为全球性的健康问题，严重威胁人类的身体健康，近年来肝硬化患者死亡率急剧增加。所幸研究表明，肝纤维化是可以逆转的，但是肝硬化不容易逆转，因此成功地治疗肝纤维化，可以减少肝硬化和肝癌患者的发病率和死亡率。目前临床对肝纤维化和肝硬化唯一有效的治疗方法就是肝移植，但是肝移植存在供体有限、成本高昂并需要终身免疫抑制治疗等缺点，因此弄清肝纤维化发生发展机制，提供有效的治疗方法，控制肝硬化的发生发展是目前肝纤维化研究的重大科学问题。　　 无论什么原因引起的肝纤维化，其主要机制均与细胞外基质(Extracellularmatrix，ECM)合成增多和降解相对不足有关。肝损伤因子导致肝细胞损伤坏死，引起多种因子分泌，细胞因子作用于静息状态的肝星状细胞(HepaticStellateCell，HSC)，使其激活、转化为成肌纤维细胞。HSC是产生细胞外基质的主要细胞，活化后α-SMA表达增多，合成胶原能力增强，分泌大量的ECM，使肝脏ECM的合成与降解失衡，ECM在肝脏过度沉积导致肝脏结构改变，从而引起肝纤维化甚至肝硬化。HSC活化后产生的细胞外基质成分包括胶原、糖蛋白、蛋白多糖及多种细胞因子;细胞因子包括TGFβ1、TNF-α、干扰素-γ、白细胞介素-1α等。其中TGFβ1是刺激HSC产生细胞外基质的主要因子，随着肝纤维化发生，细胞因子参与的各种信号通路之间的平衡状态被打破，TGFβ1在肝组织中的表达明显增加，增高的TGFβ1刺激肝脏产生各种细胞外基质并抑制其降解，促使肝纤维化发生发展。　　 TGFβ1-Smad3是引起肝纤维化的主要信号通路，TGFβ1激活HSC的信号传导过程为:TGFβ1活化后，与TGFβⅡ型受体结合形成异二聚体，随即被Ⅰ型受体识别并结合组成受体异聚体复合物，异聚体复合物中的Ⅰ型受体被Ⅱ型受体磷酸化，磷酸化的Ⅰ型受体将信号放大并进一步磷酸化胞浆中的Smad3或Smad2，磷酸化的Smad3和Smad2分别与Smad4分子形成Smad复合物并进入细胞核内与靶基因结合调控其转录和表达。其中TGFβ1Ⅰ(TβRⅠ)型受体可被小分子化合物SB431542抑制，它和TβRⅠ型受体ALK5激酶的ATP结合位点特异性结合，阻断下游效应分子Smad3的磷酸化，抑制TGFβ1诱导的Smad蛋白在核内聚集，减缓纤维化进程。　　 Slit2-Robol是最初在果蝇神经系统发育中被发现的一种信号通路，它不仅在神经系统轴突导向生长、神经元迁移、哺乳动物前脑嗅球的形成中起重要作用，在脊椎动物非神经系统发育中也具有重要作用，如参与乳腺和卵巢的发育。目前研究表明，Slit2-Robol也参与多种病理过程，如可以抑制白细胞趋化、抑制炎症过程中皮肤部位郎罕氏细胞的迁移运动;参与血管的发生及肿瘤新生血管的形成，抑制血管平滑肌细胞的迁移;参与神经胶质瘤、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、肝细胞癌等多种肿瘤发生和转移。肝癌大多发生在肝硬化基础上，肝硬化又由慢性肝炎、肝纤维化发展而来，结合上述Slit2-Robol在炎症和肝癌中的作用，我们推测Slit2-Robol可能在“慢性肝炎-肝纤维化-肝硬化-肝癌”进程中发挥重要作用。　　 目的:　　 本研究旨在通过检测Slit2-Robol及TGFβ1通路相关分子在肝纤维化中的表达变化和相互联系，初步探讨Slit2-Robol通过TGFβ1-Smad3信号通路在肝纤维化中的作用，为肝纤维化的诊断和治疗提供新思路。　　 方法:　　 1.CCl4诱导C57和Slit2-Tg小鼠肝纤维化模型的建立　　 Slit2-Tg转基因小鼠和其背景C57小鼠，均按2ml/kg体重腹腔注射20％的CCl4橄榄油溶液，每周注射2次，分别注射2周、4周、6周、8周，比较不同注射周期肝脏的纤维化程度;选取肝脏发生了明显纤维化的注射周期作为后续研究的模型。　　 2.C57和Slit2-Tg小鼠对照及肝纤维化组肝组织Slit2和Robol表达检测　　 采用免疫组化、免疫荧光、RealtimeRT-PCR和Westernblot方法分别检测Slit2、Robol在C57和Slit2-Tg小鼠对照组(C57/con，Slit2-Tg/con)和肝纤维化组(C57/CCl4，Slit2-Tg/CCl4)的表达。　　 3.R5阻断肝纤维化C57小鼠内源性Slit2-Robol信号实验的建立　　 R5是RobolN端的功能性阻断单抗，mIgG是R5的同型对照抗体。以腹腔注射20％CCl4橄榄油溶液6周的C57肝纤维化小鼠(C57/CCl4)为对照，分别建立C57小鼠腹腔注射CCl4和R5的R5处理组(C57/CCl4/R5)小鼠，以及腹腔注射CCl4和mIgG的R5处理对照组小鼠(C57/CCl4/mIgG)。　　 4.C57/con,C57/CCl4,Slit2-Tg/con,Slit2-Tg/CCl4,C57/CCl4/mIgG,C57/CCl4/R5组小鼠肝脏纤维化程度及α-SMA表达检测　　 通过H&E、天狼猩红和Reticulin染色方法，分别观察肝组织结构、肝脏胶原纤维含量和网状纤维含量的变化，比较肝纤维化程度。通过免疫荧光染色检测α-SMA表达，比较活化HSC细胞的变化。通过α-SMA和Robol免疫荧光共定位，观察Slit2-Robol和HSC活化的关系。　　 5.C57/con,C57/CCl4,Slit2-Tg/con,Slit2-Tg/CCl4,C57/CCl4/mIgG,C57/CCl4/R5组小鼠肝组织Slit2-Robol及TGFβ1-Smad3通路相关蛋白表达检测　　 采用Westernblot检测各组Robol、TGFβ1、p-Smad3、Smad2/3及α-tubulin蛋白的表达。　　 6.SB431542抑制体内TGFβ1-Smad3信号通路前后，小鼠肝纤维化程度及p-Smad3、α-SMA和Robol的检测　　 C57和Slit2-Tg小鼠注射CCl4诱导肝纤维化同时，腹腔注射SB431542(C57/CCl4/SB431542,Slit2-Tg/CCl4/SB431542)和溶剂DMSO(C57/CCl4/DMSO，Slit2-Tg/CCl4/DMSO)，5mg/kg，每周注射1次，共注射6周完成模型建立。采用H&E、天狼猩红和Reticulin染色，分别观察肝组织结构、肝脏胶原纤维含量和网状纤维含量的变化，比较肝纤维化程度。通过免疫荧光染色检测α-SMA表达，比较活化HSC细胞的变化，通过Westwernblotting检测p-Smad3、α-SMA和Robol的表达。　　 7.Slit2-Robol及TGFβ1-Smad3信号通路阻断前后，人肝星状细胞LX-2中相关蛋白表达检测　　 重组人TGFβ1刺激LX-2活化后，分别用RooblsiRNA和R5阻断LX-2细胞内源性Slit2-Robol，通过免疫荧光检测α-SMA和Robol的共定位表达，Westernblot检测Robol、α-SMA、TGFβ1和p-Smad3的表达变化。SB431542阻断TGFβ1-Smad3信号通路后，通过Westernblot检测Robol的表达。　　 8.临床肝纤维化组织标本中Robol的表达检测　　 H&E、天狼猩红和Reticulin染色观察肝纤维化程度;免疫组化染色检测α-SMA的表达，免疫荧光检测α-SMA和Robol的表达及共定位情况，分析α-SMA、Robol和肝纤维化分期之间的相关性，Robol和α-SMA之间的相关性。　　 9.肝纤维化程度判断标准　　 按照IshakStage标准，小鼠肝纤维化分为0-6期:“0”无纤维增生;“1”一些汇管区生成纤维，有或者无短的纤维间隔;“2”大多数汇管区生成纤维，有或者无短纤维间隔;“3”大多数汇管区生成纤维，门管区之间偶尔有纤维连接;“4”汇管区生成纤维，门管区之间形成明显的纤维连接;“5”门管区之间形成大量明显的纤维连接，可见纤维结节;“6”大量的纤维结节形成。　　 根据Metavir评分系统，人肝纤维化分为0-4期:“0”无纤维增生;“1”仅门管区和门管区周围纤维化;“2”门管区周围纤维化并形成少量纤维间隔;“3”纤维间隔呈桥状连接;“4”肝硬化。　　 10.统计学处理　　 所有数据均使用SPSS13.0统计软件进行统计分析。多组间比较采用ANOVA分析，两组间比较采用t检验，Robol、α-SMA之间以及它们和肝纤维化分期之间的相关性用Spearmans相关分析，结果用均数±标准差表示，P＜0.05具有统计学差异。　　 结果:　　 1.小鼠肝纤维化模型的建立　　 C57和Slit2-Tg小鼠腹腔注射20％CCl4橄榄油诱导肝纤维化，H&E染色结果显示，随着注射时间延长，肝纤维化程度逐渐加重(F=83.932，P=0.000)，而且Slit2-Tg小鼠肝纤维化分期评分高于相同注射周期的C57小鼠(F=138.856，P=0.000)，C57小鼠腹腔注射20％CCl4橄榄油0、2、4、6、8周的病理分期评分分别是0，0.50±0.63，1.67±0.88，2.92±0.80，4.42±1.11;Slit2-Tg小鼠腹腔注射20％CCl4橄榄油0、2、4、6、8周的病理分期评分分别是0，0.75±0.61,2.08±0.80，4.42±0.66,5.92±0.20。天狼猩红染色结果显示，C57和Slit2-Tg小鼠空白对照组及橄榄油溶剂对照组的肝组织中仅少数大血管周围可见红色胶原纤维，C57和Slit2-Tg小鼠空白对照组肝脏胶原纤维含量均为0.04±0.01％，橄榄油溶剂对照组小鼠肝脏胶原纤维含量均为0.04±0.01％，C57和Slit2-Tg小鼠溶剂对照组和空白对照组之间均无统计学差异(P=0.707，P=0.809)。20％CCl4橄榄油诱导后，随着注射时间延长，C57和Slit2-Tg小鼠肝脏中胶原纤维含量均逐渐增加(F=181.763，P=0.000)，相同注射周期的Slit2-Tg小鼠肝脏中胶原纤维含量比C57小鼠含量高(F=61.027，P=0.000)。C57小鼠0、2、4、6、8周肝脏中胶原纤维含量分别是0.04±0.01，0.33±0.07，0.91±0.56，1.92±0.51,4.01±1.22;Slit2-Tg小鼠0、2、4、6、8周肝脏中胶原纤维含量分别是0.04±0.01，0.44±0.14，1.75±0.19，3.95±0.88，6.65±0.47。上述H&E和天狼猩红染色结果表明，橄榄油不会对C57小鼠和Slit2-Tg小鼠产生影响、不会诱发小鼠肝纤维化。20％CCl4橄榄油诱导6周，C57和Slit2-Tg小鼠肝脏均形成明显的纤维化，且Slit2-Tg小鼠肝脏纤维化程度高于C57小鼠，因此本课题选用20％CCl4橄榄油诱导6周的肝纤维化经典动物模型作为后续动物研究的基础。　　 2.C57和Slit2-Tg小鼠肝纤维化后肝脏Slit2-Robo1被激活　　 免疫组化及免疫荧光检测发现，C57和Slit2-Tg小鼠被诱导肝纤维化后，肝组织中Slit2阳性表达量(IOD)明显高于对照组(F=213.110，P=0.000)，C57小鼠肝脏IOD值由C57/con组的0.01±0.00％增加到C57/CCl4组的0.29±0.11％，Slit2-Tg小鼠肝脏IOD值由Slit2-Tg/con组的0.02±0.00％增加到Slit2-Tg/CCl4组的0.64±0.08％，Slit2-Tg组肝脏的IOD值高于对应的C57组(F=33.690，P=0.000)。肝纤维化C57和Slit2-Tg小鼠肝组织Robol阳性表达量明显高于对照组(F=100.372，P=0.000)，C57小鼠肝脏Robol的IOD值由C57/con组的0.02±0.01％增加到C57/CCl4组的0.37±0.11％，Slit2-Tg小鼠肝脏IOD值由Slit2-Tg/con组的0.04±0.00％增加到Slit2-Tg/CCl4组的0.76±0.21％，Slit2-Tg小鼠肝脏IOD值高于C57组(F=14.788，P=0.001)。RealtimeRT-PCR结果显示，肝纤维化C57小鼠Slit2表达上调2.75±1.34倍，Robol表达上调11.29±1.05倍;肝纤维化Slit2-Tg小鼠Slit2表达上调7.60±5.10倍，Robol表达上调14.36±3.91倍(t=-1.874，P=0.027;t=-1.544，P=0.044)。Westernblot检测到的Slit2和Robol表达变化趋势同免疫组化和RealtimeRT-PCR。提示小鼠肝纤维化时，Slit2-Robol被激活。　　 3.Slit2-Robol促进小鼠肝纤维化进程　　 H&E染色发现，C57/con和Slit2-Tg/con组小鼠肝脏肝小叶结构清晰，病理分期评分为0分。C57/CCl4和Slit2-Tg/CCl4组小鼠肝脏正常的肝小叶结构被破坏，病理分期评分分别是3.10±0.99和4.40±0.84(t=-3.153，P=0.006)，C57/CCl4/R5和C57/CCl4/mIgG组肝脏的H&E染色病理分期评分分别是2.20±0.92和3.70±0.82(P=0.003)。用天狼猩红方法对胶原纤维进行定量，结果显示，C57/con和Slit2-Tg/con组小鼠肝脏中胶原纤维仅存在于少数大血管周围，汇管区无胶原纤维异常沉积，胶原纤维含量分别是0.05％±0.02％和0.06±0.02％。C57/CCl4和Slit2-Tg/CCh组小鼠肝脏胶原纤维含量分别是1.95±1.01％和4.06±1.58％，C57/CCl4/R5和C57/CCl4/mIgG组肝脏胶原纤维含量分别是0.65±0.34％和1.87±0.99％(P=0.019)。Reticulin网状纤维染色结果显示，C57/con和Slit2-Tg/con组小鼠肝脏中网状纤维无异常聚集，网状纤维含量分别是1.13％±0.14％和1.11±0.18％。CCl4诱导肝纤维化后，网状纤维聚集成黑色条索状，C57/CCl4和Slit2-Tg/CCl4组小鼠肝组织网状纤维含量分别是18.58±1.75％和42.07±1.22％，C57/CCl4/R5和C57/CCl4/mIgG组肝脏胶原纤维含量分别是7.52±0.99％和20.77±1.19％(P=0.000)。免疫荧光检测肝组织α-SMA发现，C57/con和Slit2-Tg/con组小鼠肝脏仅大血管平滑肌细胞胞浆呈阳性表达，IOD值分别是0.10±0.03％和0.01±0.00％。CCl4诱导小鼠肝纤维化后，α-SMA表达增加，C57/CCl4和Slit2-Tg/CCl4组肝脏α-SMA表达的IOD值分别是0.54±0.20％和1.24±0.32％，C57/CCl4/R5和C57/CCl4/mIgG组组肝脏IOD值分别是0.12±0.02％和0.52±0.19％(P=0.018)。Slit2-Tg小鼠肝纤维化程度和α-SMA表达明显高于C57小鼠;R5功能性阻断C57小鼠内源性Slit2-Robol通路后，小鼠肝纤维化程度降低，α-SMA表达减少;小鼠纤维化肝脏中α-SMA和Robol共定位表达。提示Slit2过表达在小鼠肝纤维化发生中起重要作用，Slit2-Robol可能通过活化HSC促进CCl4诱导的小鼠肝纤维化。　　 4.C57/con,C57/CCl4,Slit2-Tg/con,Slit2-Tg/CCl4,C57/CCl4/mIgG,C57/CCl4/R5组小鼠肝脏Slit2-Roobl及TGFβ1-Smad3通路相关分子表达变化　　 Westernblot检测结果表明，Robol、TGF-β1及下游分子p-Smad3在肝纤维化组表达增加，且Slit2-Tg/CCl4组比C57/CCl4组增加明显;R5阻断Slit2-Robol通路后，它们的表达均下降。　　 5.SB431542抑制体内TG.Fβ1-Smad3信号通路后，C57和Slit2-Tg小鼠肝纤维化程度降低、p-Smad3和Robol表达减少　　 TGFβ1Ⅰ型受体抑制剂SB431542处理C57和Slit2-Tg肝纤维化小鼠后，肝脏相对重量降低。H&E染色结果显示，C57和Slit2-Tg肝纤维化小鼠肝小叶结构破坏，肝细胞索排列紊乱。肝纤维化C57和Slit2-Tg小鼠腹腔注射SB431542后，肝脏损害明显减轻。C57/CCl4/DMSO组和C57/CCl4/SB431542组H&E染色病理分期评分分别是3.30±0.82和2.20±1.14，降低了33.3％(t=2.480，P=0.023);Slit2-Tg/CCl4/DMSO组和Slit2-Tg/CCl4/SB431542组H&E染色病理评分分别是4.50±0.71和2.20±0.79，降低了51.1％(t=6.866，P=0.000)。天狼猩红染色发现，SB431542处理后C57肝纤维化组和Slit2-Tg肝纤维化组小鼠肝脏胶原纤维含量均减少。C57/CCl4/DMSO组和C57/CCl4/SB431542组胶原纤维含量分别是2.16±0.43％和1.57±0.29％，降低了27.3％(t=3.259，P=0.006);Slit2-Tg/CCh/DMSO组和Slit2-Tg/CCl4/SB431542组胶原纤维含量分别是4.10±0.94％和2.33±0.53％，降低了43.2％(t=4.624，P=0.000)。Reticulin染色显示，腹腔注射TGFβ1受体抑制剂SB431542后，C57肝纤维化组和Slit2-Tg肝纤维化组小鼠肝脏网状纤维含量均减少。C57/CCl4/DMSO组和C57/CCl4/SB431542组网状纤维含量分别是22.48±2.21％和17.52±1.98％，降低了22.1％（t=3.726，P=0.006）;Slit2-Tg/CCl4/DMSO组和Slit2-Tg/CCl4/SB431542组网状纤维含量分别是40.76±2.74％和23.26±1.54％，降低了42.9％(t=12.430，P=0.000)。SB431542处理后，C57肝纤维化组和Slit2-Tg肝纤维化组小鼠肝脏α-SMA表达减少。C57/CCl4/DMSO组和C57/CCl4/SB431542组α-SMA的表达量分别是0.70±0.10％和0.43±0.05％，降低了38.6％(t=5.975，P=0.000);Slit2-Tg/CCl4/DMSO组和Slit2-Tg/CCl4/SB431542组α-SMA的表达量分别是1.42±0.27％和0.71±0.10％，降低了50％(t=5.953，P=0.000)。以上结果显示，SB431542抑制体内TGFβ1-Smad3信号通路后，C57和Slit2-Tg小鼠肝纤维化程度降低，活化HSC细胞减少;其中Slit2-Tg小鼠降低的幅度更大。Westernblot结果显示，TGFβ1-Smad3信号通路被阻断后，C57和Slit2-Tg小鼠肝脏α-SMA、p-Smad3和Robol的表达均减少。　　 6.Slit2-Robol及TGFβ1-Smad3信号被阻断前后，人肝星状细胞LX-2中相关蛋白表达结果　　 分别通过RobolsiRNA和R5阻断LX-2细胞的Slit2-Robol信号，免疫荧光结果显示，空白对照组少数细胞胞浆α-SMA和Robol弱阳性表达。重组人TGFβ1刺激以后，α-SMA和Robol阳性表达量明显增多。LX-2细胞经重组人TGFβ1刺激并分别用RobolsiRNA以及R5处理以阻断Slit2-Robol，结果显示，Slit2-Robol被阻断后，α-SMA和Robol表达量减少，而R5同型对照抗体mIgG处理组α-SMA和Robol的表达趋势和重组人TGFβ1处理组的一致。各组肝组织中α-SMA和Robol均共定位表达。Westernblot检测α-SMA、TGFβ1、p-Smad3及Robol的表达，和空白对照组相比，人重组TGFβ1处理组LX-2细胞的α-SMA、TGFβ1、p-Smad3及Robol表达增加;RobolsiRNA及R5处理组α-SMA、TGFβ1、p-Smad3及Robol的表达比相应的对照组降低。SB431542阻断TGFβ1-Smad3信号通路后，Robol的表达也降低。以上结果表明，Slit2-Robol可能通过激活TGFβ1-Smad3通路促进LX-2细胞活化，推测TGFβ1-Smad3信号通路可能对Robol表达起正反馈调节作用。　　 7.临床肝纤维化组织标本组织形态变化及α-SMA和Robol表达　　 用H&E、天狼猩红和Reticulin染色检测肝脏纤维化程度，免疫组化染色检测α-SMA和Robol的表达变化。H&E染色可见正常肝小叶结构清晰，肝细胞索排列规整;肝纤维化后肝小叶结构破坏，肝组织被增生的纤维组织包绕分割，肝细胞索排列紊乱。天狼猩红染色显示，正常对照肝组织中仅大血管周围可见少量胶原纤维;而纤维化肝组织中可见网状或条索状的胶原纤维弥散增生，包绕肝细胞团，形成圆形或类圆形假小叶，中央静脉周围和门管区纤维组织增生明显，门静脉-中央静脉之间可见纤维桥。Reticulin染色显示，正常肝组织网状纤维呈点状或短丝状，以中央静脉为中心形成肝细胞的网状支架;纤维化肝组织中央静脉周围的网状纤维支架塌陷，网状纤维间隔粗、不规则弥散分布于细胞间，网状纤维组织和细纤维束在相邻小叶中央静脉间、或者中央静脉和汇管区之间呈桥样连接。免疫组化染色显示，对照组肝脏中α-SMA仅在大血管呈阳性表达，而纤维化肝组织表达明显增加，主要集中在汇管区和门静脉周围纤维增生的区域，F0-F4期肝组织α-SMA阳性表达量逐渐增加，α-SMA的表达和肝纤维化分期(F0-F4)呈正相关(R=0.843，P=0.000)。Robol在对照肝组织呈散在弱阳性表达，纤维化肝组织中呈弥漫强阳性表达。Robol的表达和肝纤维化分期(F0-F4)呈正相关（R=0.778，P=0.000）。同时Robol和α-SMA的表达也呈正相关关系(R=0.613，P=0.000)，而且α-SMA和Robol共定位表达。提示肝纤维化患者肝脏中的Slit2-Robol被激活，Slit2-Robol可能通过活化HSC促进肝纤维化发生发展。　　 结论:　　 1.C57和Slit2-Tg肝纤维化小鼠肝组织内Slit2-Robol信号系统被激活，激活的Slit2-Robol信号系统可能促进肝纤维化发生;　　 2.Slit2-Tg小鼠肝纤维化程度和Slit2和Robol表达高于C57小鼠，;而R5阻断Slit2-Robol后，肝纤维化减轻，Slit2和Robol表达下调。提示Slit2-Robol促进肝纤维化的发生;　　 3.Slit2-Robol促进肝纤维化机制可能与肝星状细胞(HSC)活化有关;　　 4.小鼠体内及人的肝星状细胞内，Slit2-Robol可能通过激活TGFβ1-Smad3信号通路、引起HSC活化，促进肝纤维化发生;　　 5.Slit2-Robol可能通过活化肝星状细胞(HSC)促进人的肝纤维化进程。　　 创新点　　 1.提出Slit2-Robol可能通过活化HSC促进肝纤维化发生发展的新观点;　　 2.提出Slit2-Robol可能通过激活TGFβ1-Smad3信号通路，促进肝纤维化发生，为肝纤维化发生机制提供新理论;　　 3.证实R5和SB431542均可减轻肝纤维化的发生，为肝纤维化的防治提供新思路。