自2013年在中国长三角地区首次出现以来,H7N9亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)引起严重的人感染事件,造成的病死率较高,给公共卫生安全带来了巨大挑战。2016年底,出现了高致病性(highlypathogenic,HP)H7N9禽流感病毒的变异株,在鸡群中引起疫病的暴发,给家禽养殖业带来了巨大的经济损失。疫苗接种是防控禽流感的最有效措施之一。但是,目前临床使用的H7N9禽流感灭活疫苗只能通过肌肉注射方式进行免疫,存在接种费时费力、仅能诱导体液免疫、导致禽群应激等缺点。新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是构建家禽双价疫苗的理想载体,具有安全性好、繁殖性能强、能够诱导粘膜、体液和细胞免疫、可通过喷雾、饮水等途径进行大规模免疫接种等优点。因此,本研究的目的是以NDV为载体表达H7N9亚型AIV的主要保护性抗原——血凝素(hemagglutinin,HA)基因,构建活载体疫苗并评价其免疫效力。另外,H7N9亚型AIV是一种新发人兽共患传染病,对病毒HA蛋白抗原表位的认识还不全面。因此,本研究利用针对H7N9HA蛋白的一系列单克隆抗体,对HA蛋白的B细胞抗原表位进行排谱,并鉴定其中的免疫优势表位,为疫苗设计改造提供参考。1.表达H7N9亚型禽流感病毒HA基因的重组新城疫病毒活载体疫苗的构建与评价本研究以一株致弱的重组基因Ⅶ型NDV(rAI4)为骨架,并选取与各年份分离株交叉反应性良好的 H7N9 毒株(A/chicken/Guangdong/GD15/2016,GD15)作为HA基因的供体,通过反向遗传学构建了一株表达H7N9 HA基因的重组新城疫病毒载体疫苗(rAI4HA)。体外试验结果显示,该重组疫苗的基本生物学特性与母本病毒rAI4相似,在细胞及鸡胚中均具有较高的繁殖滴度,且毒力较低。另外,重组病毒在鸡胚中连续传代后,能够稳定表达HA蛋白,且未发现任何基因突变,表明疫苗的遗传稳定性良好。动物免疫试验显示,使用106半数鸡胚感染量(50%embryo infectiousdose,EID50)的rAI4HA经滴鼻点眼途径免疫2周龄SPF鸡,免疫后2周即可诱导产生较高的针对NDV的血凝抑制(hemagglutination inhibition,HI)抗体,与载体疫苗rAI4相似。但是,rAI4HA在免疫后第4周诱导的针对H7N9的HI抗体较低(平均滴度:2 log2),血清转化率仅为20%(HI≥4 log2)。病毒中和(virusneutralization,VN)实验显示,rAI4HA免疫鸡血清对H7N9病毒没有中和活性。值得注意的,当使用ELISA方法进行检测时,免疫血清中存在针对H7N9HA蛋白高水平的IgY抗体(平均滴度:200)。攻毒保护试验结果显示,当使用105 EID50的HPH7N9病毒进行攻毒时,未免疫鸡在攻毒后3天内全部死亡,且表现严重的临床症状;rAI4免疫鸡在攻毒后7天内也全部死亡;rAI4HA免疫鸡在攻毒后未显示任何临床症状且未发生死亡。此外,与空载体rAI4相比,rAI4HA免疫鸡攻毒后的排毒率与排毒量显著下降。以上结果说明,候选疫苗株rAI4HA的繁殖滴度高、安全性与遗传稳定性较好,一次免疫即可诱导针对NDV与H7N9较高的抗体应答,能够提供针对H7N9病毒感染的100%的保护率,且能显著抑制排毒,在H7N9禽流感防控中显示较大的潜力。此外,rAI4HA诱导的抗体反应以较低的HI抗体、较高的H7N9特异性IgY抗体为特征,提示至少对于NDV-H7N9载体疫苗而言,传统的血清学指标不能准确反映疫苗真实的免疫效果。2.H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白B细胞抗原表位的预测及排谱重组载体疫苗rAI4HA虽然只能诱导产生低水平的针对H7N9的HI/VN抗体水平,却能诱导高水平的IgG抗体,可能与H7N9HA蛋白特殊的免疫特性有关,即HA蛋白中的非中和性B细胞抗原表位可能取代传统的HI/VN表位而成为优势表位。因此,本研究使用多个预测工具对HA蛋白潜在的B细胞抗原表位进行预测,综合预测结果设计并合成了 19条多肽,基本覆盖全长HA蛋白。我们用合成的多肽与24株H7N9 HA特异性的单克隆抗体反应,对HA蛋白的线性B细胞表位进行排谱。结果显示,8株单克隆抗体能与多肽特异性结合,其中有部分抗体识别的是相同的表位。共鉴定3个新的线性B细胞表位,均位于HA蛋白茎部区,且识别这些表位的单克隆抗体均没有HI/VN活性。然后,将筛选到的3条多肽进行截短对抗原表位进行了精细定位,以此鉴定了其中两个抗原表位的核心基序,分别为373-TAA-375与459-E。将鉴定的核心基序氨基酸位点突变后,HA蛋白与对应抗体的反应性丧失或减弱。但是,其中一条多肽截短后均不再与单抗发生反应,提示该单抗可能识别的是构象表位。我们使用噬菌体表面展示随机多肽文库对该单抗识别的表位进行筛选,鉴定了其结合的模拟肽基序为HEMWGLHSFDMT。序列比对结果显示,该模拟表位位于HA蛋白茎部区428-450 aa,是由不连续氨基酸位点组成的构象型B细胞表位,429-E-431-W-445-H-448-D为该表位的核心位点。因此,我们用单抗排谱的方法在H7N9 HA蛋白的茎部区中鉴定了 3条新的非中和抗体识别的抗原表位,2条为线性表位,1条为构象表位。3.H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白优势表位的鉴定NDV-H7N9载体疫苗诱导的抗体以高水平的非中和抗体为主,说明这些抗体识别的抗原表位可能是HA蛋白的优势表位。为了鉴定H7N9 HA蛋白中的优势抗原表位,我们用合成的多肽与不同来源的H7N9抗血清反应,并用竞争ELISA的方法鉴定NDV-H7N9免疫血清识别的优势表位。结果显示,HA蛋白19条潜在的线性B细胞表位与H7N9灭活疫苗免疫鸡与小鼠血清以及NDV-H7N9免疫鸡血清均不反应;部分表位与H7N9病毒感染鸡血清反应,其中HA茎部区的表位与血清的反应性较强。这些结果提示,HA蛋白的构象表位可能是H7N9疫苗免疫血清识别的优势表位。此外,前期peptide-ELISA实验显示,大部分单抗与线性B细胞表位不反应,表明这些单克隆抗体针对的表位也可能是构象性表位。因此,我们使用竞争ELISA方法评价这些单克隆抗体和NDV-H7N9免疫血清与HA蛋白结合的竞争性。结果显示,2B11 1F3和4B7 4D5两株单抗具有显著的竞争效应,能使免疫血清与HA蛋白的结合性下降50%左右,表明它们针对的表位是诱导NDV-H7N9疫苗抗体应答的优势表位。此外,2B11 1F3和4B74D5两株单抗与免疫血清的竞争没有叠加效应,说明它们可能针对的是同一表位。然后,我们使用噬菌体表面展示随机多肽文库对4B74D5识别的表位进行筛选,鉴定其识别的模拟肽基序为SNTALPSKFYGY,与HA蛋白序列吻合的关键氨基酸为331-N-336-P-361-Y-362-G,为单抗识别的核心基序。结果说明,H7N9疫苗诱导的抗体应答与病毒自然感染诱导的抗体应答存在明显差异,并鉴定HA蛋白331-N-336-P-361-Y-362-G基序为NDV-H7N9载体疫苗诱导抗体应答的优势表位。