绒毛膜癌(choriocarcinoma,CC)简称绒癌,是一种恶性度高且侵袭性强的滋养细胞肿瘤,大多数继发于正常妊娠或异常妊娠。我国和东南亚国家发病率相对较高,主要发生在育龄期的女性,也可见于男性。绒癌的发生机制目前尚不明确,易经血道转移而病情恶化。但对化疗药物较为敏感,因此在治疗上以化疗为主,以手术和放疗等综合治疗为辅助手段。虽然化疗是绒癌治疗的首选,但是使用剂量必须达到患者的最大耐受量且需要连续治疗多个疗程才能达到理想效果,由于同时接受的毒副作用也相应增加,部分患者出现不耐受毒副作用而被迫终止治疗,也有患者在治疗中出现了耐药,最终影响了治愈率。因此,研究绒癌的发生机制以及寻找高效低毒的化疗药物成为治疗绒癌亟待解决的问题。二氢杨梅素(dihydromyricetin,DMY),又名蛇葡萄素,是一种二氢黄酮醇化合物,从葡萄科蛇葡萄属植物藤茶中分离得到,其中又以藤茶的幼嫩茎叶中含量最高。藤茶是我国一种丰富和可利用的植物资源。研究发现二氢杨梅素具有抗氧化、抗炎、抑菌、降血糖、降血脂、保肝护肝、增强人体的免疫力等多种生理活性。近年来随着对二氢杨梅素研究的深入,又发现其在抗肿瘤,保护心血管系统,保护皮肤抗老化以及改善代谢疾病等方面的生理活性,特别是其在抗肿瘤方面的作用日益受到人们的重视。转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGFβ)是一种具有多功能的细胞因子,在肿瘤中起作用,可影响肿瘤细胞的增殖、分化、转移、介导细胞凋亡及肿瘤的发生。TGFβ-Smads信号转导通路由该通路的配体、受体、Smads蛋白以及调节的靶基因组成。通路中任何一部分功能的异常都可能导致转导信号的紊乱,进而影响肿瘤的发生与发展。课题组前期体外细胞实验研究发现:TGFβ-Smads信号通路与绒癌细胞的增殖有关;二氢杨梅素具有抑制绒癌细胞生长的作用;二氢杨梅素可能通过TGFβ-Smads信号通路抑制绒癌细胞的增殖。为进一步研究二氢杨梅素的抗肿瘤效果及其作用机制,本文从体内实验水平开展了以下研究:第一部分人绒毛膜癌JAR细胞裸鼠移植瘤模型的建立目的:建立人绒毛膜癌JAR细胞裸鼠移植瘤模型,研究其生物学特性。方法:1.培养绒癌JAR细胞,并制作细胞悬液。2.12只Balb/c雌性裸鼠随机分为对照组和实验组,实验组将含1×10~7个绒癌JAR细胞的悬液注射于裸鼠股背处皮下,对照组于相同部位注射等体积生理盐水。记录成瘤率,测量肿瘤直径并观察裸鼠的生存状态。3.HE染色方法分别观察JAR细胞、移植瘤及主要易转移脏器的组织病理学变化。4.免疫组织化学方法检测移植瘤组织中β-HCG蛋白的表达。5.ELISA方法检测β-HCG血清水平。结果:1.实验组8只裸鼠全部成瘤,移植瘤的成瘤率为100%。裸鼠带瘤生存时间为(24.75±3.41)天。2.HE染色显示移植瘤组织中的绒癌细胞与体外培养JAR细胞组织结构具有相似性。全身主要易转移脏器未发现到转移情况。3.免疫组织化学检测结果发现,实验组移植瘤组织中β-HCG主要在绒癌细胞的胞质中表达。4.ELISA方法显示实验组成瘤裸鼠β-HCG血清水平(7.11±2.47)ng/ml明显高于对照组裸鼠(4.57±1.31)ng/ml(P<0.05)。结论:通过在裸鼠皮下注射绒癌细胞的悬液方式建立绒癌JAR细胞裸鼠移植瘤模型,该方法具有易操作、成瘤率高及周期短的特点。第二部分二氢杨梅素通过TGFβ-Smads信号通路抑制绒毛膜癌生长的体内研究目的:探讨二氢杨梅素(DMY)以及联合氨甲喋呤(MTX)对裸鼠人绒毛膜癌移植瘤生长的影响,观察二氢杨梅素的毒副反应,并通过检测二氢杨梅素对绒癌移植瘤组织中β-HCG、TGFβRⅡ、Smad2、P-smad2、C-myc的表达水平的影响初步探讨其作用机制。方法:1.培养人绒毛膜癌JAR细胞,并制作细胞悬液。2.建立人绒癌裸鼠皮下移植瘤模型成功后,将36只裸鼠随机分为6组:对照组、二氢杨梅素低浓度组(50mg/kg)、二氢杨梅素中浓度组(100mg/kg)、二氢杨梅素高浓度组(150mg/kg)、氨甲喋呤组(0.5mg/kg)、二氢杨梅素(100mg/kg)联合氨甲喋呤组(0.5mg/kg)。二氢杨梅素和氨甲喋呤分别采取灌胃和腹腔注射方式给药。观察裸鼠的状态及移植瘤的一般特性。3.治疗14天后处死,测量裸鼠体重、脾脏重量、肿瘤重量及肿瘤长短径,计算脾脏指数、肿瘤体积和质量抑瘤率。4.血清生化检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)及肌酸激酶(CK)。5.ELISA法检测血清β-HCG水平。6.HE染色观察各组移植瘤组织的病理变化7免疫组织化学法检测各组移植瘤组织中β-HCG、TGFβRⅡ、Smad2、P-smad2、C-myc的表达水平。8.Western blot法检测各组移植瘤组织中TGFβRⅡ、Smad2、P-smad2、C-myc的蛋白表达水平。结果:1.二氢杨梅素能明显抑制绒癌裸鼠皮下移植瘤的生长,且呈剂量依赖性。二氢杨梅素低浓度组、中浓度组和高浓度组的裸鼠移植瘤质量抑瘤率分别为18.28%、23.62%和24.31%。氨甲喋呤组能显著抑制移植瘤生长,质量抑瘤率为30.53%,二氢杨梅素联合氨甲喋呤组抑瘤率为40.71%(P<0.05)。另外病理组织学检查结果也显示,氨甲喋呤组及联合用药组的移植瘤组织中的细胞坏死情况较其他组严重,肿瘤细胞数量明显少于其他组。2.二氢杨梅素能显著降低谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)及肌酸激酶(CK)水平(P<0.05),对肝细胞及心肌细胞有一定的保护作用,并能减轻氨甲喋呤毒副作用引起的肝细胞及心肌细胞的损伤。3.免疫组织化学结果显示,二氢杨梅素组移植瘤中β-HCG、TGFβRⅡ、Smad2、P-smad2、C-myc表达水平均低于对照组(P<0.05)。4.Western blot结果显示,二氢杨梅素联合氨甲喋呤能够降低TGFβRⅡ、Smad2、P-smad2、C-myc蛋白的表达水平(P<0.05)。结论:1.二氢杨梅素能显著抑制绒癌移植瘤的生长,联合氨甲喋呤具有协同增效抗肿瘤的作用。2.二氢杨梅素能够减轻肝细胞及心肌细胞的损伤,减轻氨甲喋呤引起的毒副作用。3.二氢杨梅素能够抑制绒癌移植瘤的生长机制可能与调控TGFβ-Smads信号通路转导,下调TGFβRⅡ、Smad2、P-smad2、C-myc的表达有关。