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牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）是由囊膜包裹的单股正链RNA病毒,属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）,BVDV侵袭机体后可引起持续性感染,对全球养牛业造成了不可估量的损失。目前对BVDV进行预防的主要措施为接种具有良好免疫效果的疫苗,在中国主要以灭活疫苗为主进行免疫和预防,而尚无BVDV的E2亚单位疫苗投入生产并使用。本研究对四川地区BVDV流行毒株E2基因进行分析,BVDV-1型E2部分基因进行原核表达并制备亚单位疫苗,并对其免疫效果进行评价,取得成果如下:1.四川地区BVDV流行毒株E2基因序列分析利用RT-PCR方法,对2021年采自四川3个地区275份牛粪便样本进行BVDV检测。结果显示,BVDV总检出率为27.64%（76/275）,进化结果分析表明均BVDV-1a亚型。从3个地区挑选15株阳性样本成功扩增出9株E2全基因并克隆测序,结果显示9株E2基因之间核苷酸长度约为1073～1100bp,同源性大概在72.4%～99%之间,而氨基酸同源性约为61.5%～100%。对已扩增的9株E2蛋白与本实验室疫苗株SMU-Z6/1a/SC/2016毒株的E2基因进行氨基酸突变位点分析及抗原决定簇预测比较。结果显示9株阳性毒株中有5株（RL6、LZ5、R3-5、LZ3、R1-1）在残基148-312内抗原决定簇与SMU-Z6/1a/SC/2016的抗原决定簇完全相同。结果表明9条E2基因与本实验室所分离的疫苗株SMU-Z6/1a/SC/2016毒株遗传关系最近,都与BVDV-1a聚在一个分支,具有一致的基因型。为了了解9株E2基因的重组现象,进行基因重组分析,结果显示只有毒株GK2的E2基因有重组,但其重组后主要亲本为本实验扩增毒株R3-14,次要亲本为SMU-Z6/1a/SC/2016,均为BVDV-1a型。本实验结果表明,BVDV-1a型在四川地区牛群中广泛存在和流行,为四川地区BVDV的防治及临床诊断提供了一定的理论依据。2.BVDV-1型E2基因蛋白原核表达、纯化及间接ELISA方法的建立根据E2序列结果,选取本实验室分离的疫苗株SMU-Z6/1a/SC/2016的E2部分基因进行扩增,并对其进行诱导表达,可溶性分析,纯化复性,通过Western Blot鉴定。结果表明成功构建E2重组原核表达载体,重组菌在0.3 m M的IPTG,37℃条件下诱导6h成功表达以包含体形式存在的E2重组蛋白,大小约为40 KDa,能与兔抗SMU-Z6/1a/SC/2016高免血清发生反应,有良好的反应原性。为了建立BVDV-1型抗体检测的间接ELISA方法,以本研究制备的BVDV E2重组蛋白为抗原,经过对抗原包被浓度、一抗等条件进行优化,建立间接ELISA检测方法。优化结果为E2蛋白的包被浓度为1μg/m L,一抗稀释度为1:100,判定OD450nm≥0.357为阳性。该方法为后续E2亚单位疫苗诱导动物抗体水平的评价提供了技术手段。3.BVDV-1型E2重组蛋白亚单位疫苗免疫效果评价为了制备BVDV-1型E2亚单位疫苗,将MONTANIDE ISA 201 VG佐剂与等体积的纯化后的E2重组蛋白进行充分乳化得到BVDV-1型E2重组蛋白亚单位疫苗,并对其进行检验,结果显示,本研究成功制备了无污染,且稳定性、安全性良好BVDV-1型E2重组蛋白亚单位疫苗。为了评价BVDV-1型E2亚单位疫苗的免疫效果,以200μg蛋白/只的剂量免疫新西兰大白兔,利用抗体中和试验和间接ELISA方法检测免疫后兔血清抗体消长规律。ELISA检测结果显示在二免14 d后血清中抗体水平最高为3.39,中和抗体效价在二免21 d达到最高,为1:186。以1 mg蛋白/头的剂量颈部肌肉注射免疫肉牛,以同样的方法检测牛血清抗体消长,结果显示,免疫牛后收集血清测定ELISA抗体效价发现在二免14 d达到最高3.3671。对牛血清中和抗体效价进行测定,E2亚单位疫苗组中和抗体在一免后即可检测到有抗体产生,二免7 d中和抗体效价达到1:285以上,二免后28 d抗体效价达到最高1:2185,最低为1:89,表明制备的E2亚单位疫苗能有效刺激兔和牛产生较高水平的特异性抗体。为了进一步研究E2亚单位疫苗能否诱导对小鼠的保护作用,本研究对SPF级BALB/c小鼠进行免疫,二免后21 d,以本实验室分离的疫苗株SMU-Z6/1a/SC/2016对每只小鼠灌胃攻毒1m L,并在攻毒后检测小鼠血常规和粪便病毒载量。结果表明,攻毒后第5 d和第9 d,E2亚单位疫苗组白细胞、淋巴细胞、血小板含量均高于灭活疫苗组和空白攻毒组,低于阴性对照组。对攻毒后小鼠粪便病毒荷载量进行测定,结果显示E2亚单位疫苗组小鼠粪便拷贝数比阴性对照组显著降低了9倍（p＜0.01）,表明本研究制备的E2亚单位疫苗能刺激小鼠产生特异性抗体,并有效抑制小鼠体内BVDV病毒的大量复制。为BVDV E2亚单位疫苗的制备提供了一定的参考数据。