背景:神经母细胞瘤（Neuroblastoma,NB）是儿童最常见的颅外实体肿瘤,约占全部儿童肿瘤的8%,中位诊断年龄约为18个月,属于自主神经系统的胚胎性肿瘤。全基因组关联研究（GWAS）表明,神经母细胞瘤是一种复杂的遗传性疾病,与可影响肿瘤形成的相关基因及其多态性有关。目前已经确定了 12组与神经母细胞瘤发生高度相关的易感位点,这为NB的分子靶向治疗提供了潜在药物筛选靶点。然而,目前NB的药物治疗仍以传统化疗为主,但其组织选择性差,长期给药可引发肝肾毒性、骨髓抑制等诸多不良反应,已严重限制了该类药物的临床应用。近年来,随着免疫治疗的兴起,肿瘤的靶向免疫治疗被认为是最具潜力的药物治疗策略,为肿瘤患者带来新的希望。然而,尽管免疫治疗在成人肿瘤中已取得巨大突破,但在NB的应用还尚在起步阶段,现有的代表性治疗药物达妥昔单抗β的临床获益也有限,这主要受制于NB免疫微环境中的诸多抑制性因素,包括肿瘤的低免疫原性、肿瘤相关免疫细胞的浸润与活性降低、肿瘤微环境对免疫细胞的抑制等。在NB的临床治疗中目前存在的问题有:对神经母细胞瘤的基因分子生物学特性探索不够透彻,潜在药物筛选靶点较少;免疫治疗研究尚处于初级阶段,可选择的免疫治疗药物极少;高危神经母细胞瘤总体疗效差等等。为了进一步探索NB的分子生物学靶点及开发针对肿瘤免疫微环境的免疫制剂,开展此实验。目的:1、以YTHDC1基因为研究对象,从表观遗传学的角度出发开展基于大量临床样本的基因型分析并探究YTHDC1基因单核苷酸多态性与NB发生发展的相关性。2、探索载cGAS-STING通路激动剂ADU-S100的纳米免疫佐剂对神经母细胞瘤在细胞及动物水平的疗效及机制,为此类制剂的开发提供实验支撑,为以NB为代表的低免疫原性、低肿瘤突变负荷的“冷肿瘤”靶向免疫治疗提供新思路。方法:基于以上事实及目的,本论文的研究内容主要分为两个部分:第一部分研究中,从表观遗传学的角度出发开展基于大量临床样本的基因型分析,以YTHDC1基因为研究对象,在中国八家医院开展了一项多中心病例对照研究,共招募898名NB患者和1734名健康志愿者,提取NB患者新鲜肿瘤组织或肿瘤石蜡切片与健康儿童血液样本中的DNA并进行基因分型,选取YTHDC1基因3个多态位点（rs2293596 T＞C,rs2293595 T＞C,rs3813832 T＞C）进行分析,构建该基因相应的siRNA验证该基因对NB细胞肿瘤生物学的作用。探究YTHDC1基因单核苷酸多态性与NB发生发展的相关性,并阐明该基因在细胞层面的生物学功能。第二部分工作使用“一锅法”合成了一种共载ADU-S100免疫激动剂的金属多酚纳米粒TA-Mn/S100 NPs,用于NB的靶向免疫治疗。该纳米制剂通过多酚材料鞣酸（Tannic acid,TA）与Mn2+配位形成,并包载cGAS-STING通路激动剂ADU-S100。对纳米粒子的水化粒径、形貌、光谱学特征等基本药剂学性质进行系统表征,使用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）与高效液相色谱仪（HPLC）探索纳米粒子体外释放行为,在明确制剂学特性的基础上,在细胞水平验证了该纳米制剂可有效递送至肿瘤细胞,诱导细胞凋亡,在蛋白质水平与基因水平验证了纳米制剂对cGAS-STING通路的激活,以及对抗原提呈细胞的活化。最后,构建小鼠皮下肿瘤移植模型,通过系统给药评价了该纳米制剂的抗肿瘤效应。结果:1.发现在多态位点rs3813832 T＞C,TC基因型可显著降低NB的易感性;此外,组合基因型分析的结果显示,具有3种保护性基因型个体罹患NB的风险显著低于其他携带1-2种保护性基因型的个体。同时,我们构建相应的siRNA在两种NB细胞系中对YTHDC1基因进行干扰,使用一系列分子生物学手段（CCK-8、Western Blot、划痕实验与迁移实验）验证该基因对NB细胞肿瘤生物学的促进作用。2.构建的免疫调控纳米制剂为180 nm左右的无定型结构,具有典型的金属配位聚合物特性。纳米制剂粒径均一,且胶体稳定性良好。紫外-可见吸收光谱与红外吸收光谱均证明药物的有效包载,且包封率为54%。体外释放研究发现,药物不仅在生理环境下能稳定包载,还能响应细胞内微酸性细胞器（如内涵体/溶酶体）及高谷胱甘肽水平释放药物,具有智能释药特性。3.该制剂可高效转运进入细胞,诱导细胞凋亡,并激活cGAS-STING通路,刺激免疫学效应。体内药效学研究表明,纳米制剂具有良好的肿瘤抑制活性,并通过免疫病理学研究证实该抗肿瘤活性主要来自于对肿瘤免疫微环境的调控,包括DC细胞的活化,T细胞的活化,巨噬细胞的极化等。与此同时,评价了该纳米制剂的体内应用安全性,发现在治疗过程中小鼠体重无明显改变,且治疗后的组织病理学表征未发现小鼠主要器官的改变,提示该制剂的生物安全性良好。结论:1.研究发现m6A修饰基因YTHDC1的遗传变异与NB的风险之间存在显著相关性,这一研究结果对于NB的发病机制、流行病学特征、表观遗传学特性及抗肿瘤药物新靶点的设计具有重要借鉴意义。2.首次利用金属多酚纳米粒共载免疫激动剂ADU-S100,协同激活cGAS-STING通路,在诱导肿瘤细胞凋亡的同时,活化抗原提呈细胞,提高肿瘤微环境中淋巴细胞的浸润,调节NB的肿瘤免疫抑制微环境。3.本研究为阐明YTHDC1基因与NB易感性之间的相关性提供了实验研究依据,同时,为以NB为代表的低免疫原性、低肿瘤突变负荷的“冷肿瘤”靶向免疫治疗提供新思路。