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前言抗叶酸治疗恶性肿瘤广泛应用于各种恶性肿瘤的化疗方案中,其中最为常用的抗叶酸药物为甲氨蝶呤（Methotraxate,MTX）（1）。它的作用机制目前主要示抑制二氢叶酸还原酶（Dihydrofolate reductase,DHFR）,进而阻碍四氢叶酸的合成,而四氢叶酸是在人体内合成嘌呤核苷酸和嘧啶脱氧核苷酸的非常重要的辅酶。没有四氢叶酸就会使嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成过程中一碳基团的转移作用受到阻碍,所以就会抑制DNA的生物合成。普拉曲沙（Pralatraxate,PTX）是一种新型的抗叶酸治疗肿瘤的药物,目前PTX被认为是MTX的升级产品（2）。是AllosTherapeutics公司开发的甲氨喋呤衍生物。普拉曲沙作为抗叶酸靶向制剂,该药除了最大程度上抑制二氢叶酸还原酶,它还有其他作用,可竞争性抑制叶酰聚谷氨酰合成酶,从而阻断胸腺嘧啶及其他依赖单碳转移的生物分子的合成,另外可以通过干扰DNA的生物合成,从而促使肿瘤细胞凋亡（3）。羟乙基磺酸盐（Palbociclib Isethionate,PAL）是细胞周期抑制剂,特异性抑制CDK4/6。2015年2月3日,辉瑞公司研发的（PD-0332991,Ibrance?）获得美国FDA加速批准。也是第一个获得FDA批准的特异性CDKs（Cyclin-dependent kinases,CDKs）抑制剂（4）。膀胱癌是临床上常见的恶性肿瘤之一,其中30%的患者初诊诊断为肌层浸润性膀胱癌（Muscle-Invasive Bladder Cancer,MIBC）（5）,是指临床分期为T2T4的膀胱癌。具有进展快,易复发,易远处转移,恶性程度高,病死率高等特点。膀胱癌作为恶性肿瘤的一种,尤其是肌层浸润性膀胱癌可以在某种程度视为一种全身性疾病,也就是说他们具有了肿瘤全身转移的能力,所以在治疗这类肿瘤时,除了传统的膀胱全切手术,也叫根治性膀胱切除术（Radical,Cystectomy,RC）（6）,手术同时行盆腔淋巴结清扫术（Pelvic Lymph Node Dissection,PLND）,手术后前后也应该进行全身性治疗,比如全身化疗。目前对于膀胱癌的新辅助化疗越来越受到人们的重视。现阶段经典的膀胱癌一线化疗方案为GC（吉西他滨gemcitabine和顺铂cis-platinum）方案和MVAC（氨甲蝶呤、长春碱Vincristine、阿霉素Adriamycin、顺铂）方案（7）。但是由于膀胱癌本身的易复发性及易耐药性的产生,临床上经常出现化疗无效的情况的出现。因此就现阶段而言,我们针对于化疗经典化疗方案的耐药情况,我们需要研究新的简单有效的化疗方案。DHFR是CDK4/6下游通路上表达的众多蛋白的一个（8）,本实验拟应用CDK4/6抑制剂从而抑制DHFR的表达,减少抗叶酸药物的靶点,从而提高抗叶酸药物的作用效果。本实验从细胞水平验证了抗叶酸药物与特异性细胞周期抑制剂联合应用治疗膀胱癌的可行性。为将来膀胱癌化疗提供了一种新思路。实验材料与方法一、实验材料1、药物MTX、PTX、PALMTX来源于MDAnderson肿瘤中心药物部门。PTX来源于AllosTherapeutics公司馈赠,我们协助公司完成不同肿瘤细胞中的药效比较。PAL通过www.selleckchem.com购买,药品产自于辉瑞公司。2、野生型膀胱癌细胞系5637及T24两种细胞系均来自于休斯顿大学李教授惠赠。3、实验试剂（1）RPMI1640培养基:美国Hyclone公司（2）胎牛血清:美国Hyclone公司（3）WST1试剂:同仁化学研究所（Dojindo）（4）DMSO:美国Sigma公司（5）TRIZOL:宝泰克生物公司（6）RIPA裂解液:美国Sigma公司（13）BCA法蛋白浓度测定试剂盒:美国Sigma公司（14）5 X Loading Buffer:美国Sigma公司（15）SDS-PAGE凝胶配制试剂盒:美国Sigma公司（16）超敏ECL化学发光试剂盒:美国Sigma公司（17）鼠抗人DHFR:Santa Cruz公司（18）FITC-MTX:美国Invitrogen公司（19）Caspase3试剂盒:美国Invitrogen公司（20）CountBright?Absolute Counting Beads试剂盒:Thermofish scientific,美国4、主要仪器设备（1）离心机:Eppendorf型,德国（2）二氧化碳培养箱:HERA cell 150型,德国（3）超净工作台:美国labconco超净工作台（4）倒置显微镜:Olympus CKX31型,日本（5）酶标仪:BIOTEK-ELX808,美国（6）生化摇摆平台:沃德生物医学仪器公司（7）稳压稳流型电泳仪、电泳槽:美国CBS Scientific（8）成像分析照相系统:GBOX,美国基因有限公司（9）流式细胞仪:Thermofish scientific,美国（10）免疫荧光成像仪:美国focus公司（11）洗片机:美国柯达mxp102医用洗片机二、实验方法（一）离心法收集肿瘤细胞1、将细胞消化吹打后转移至离心管离心2、倒去上清,加1 mlPBS打匀后转移至1.5 ml EP管3、离心800 rpm 5 min4、倒去上清,收集细胞。（二）细胞培养野生型白人膀胱癌细胞系5637及T24细胞。在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中,温度37℃,湿度为饱和湿度,5%二氧化碳的培养箱中培养。（三）WST-1进行IC50测定1.一般在细胞增殖实验中,每个孔中先加入100ul2000个细胞液体,在细胞毒性实验中,每个孔中加入100ul液体包含10000个细胞,（当然具体每孔中所加的细胞数目,需根据细胞的大小、细胞增殖速度等因素决定）。根据实验要求,先行培养,然后加入0-10ul特定的药物处理。2.如果每孔原有100ul液体,则在每孔中需要加入10ulWST-1溶液。如果原来的培养液体积为200ul,则需加入20ulWST-1溶液。另外可以用加如相同量细胞培养液和WST-1溶液但没有加任何细胞的孔作为空白对照。3.在细胞培养箱内继续孵育,约0.5-2小时就可以了。具体孵育的时间,需要根据细胞类型和细胞的密度等情况而定,在最开始的实验中可以分别在0.5、1、2小时后分别用酶标仪检测,然后通过结果分析,掌握其规律,选则吸光度范围较最好的一个时间点做后续实验的检测时间。4.把96孔板置于摇床上摇动一分钟,以充分混匀待检测体系。5.在450nm测定吸光度。6.根据电脑软件计算出IC50.（四）流式细胞仪进行细胞周期测定注意:所有操作在冰上进行。1.收集细胞到15ml的管中,离心。再用10-12mL PBS洗细胞2.沉淀细胞并重悬。3.用5mL PBS洗细胞,重复步骤2。4.孵育不超过60 min。5.离心6.用10-12mL PBS洗细胞,再用5ml洗细胞,离心7.加300ul含8%的小牛血清重悬打匀8.加5ml70%乙醇,逐滴加入,放-20度在FCM分析细胞周期的方法是:收集细胞,PBS洗涤,70%冰乙醇固定,加入PCB溶液室温低渗处理后,离心去上清,加入RNaseA消化后,加入PI.再通过流式仪进行检测。分析出细胞周期。（五）流式细胞仪检测细胞凋亡1.细胞收集:先将收集悬浮细胞到10ml的离心管中,每管中细胞数为（28）×106,/mL 500800r/min离心5min,弃去培养液。2.再用PBS缓冲液洗涤1次,500800r/min离心5min。3.用100ul的带标记的溶液重悬细胞,室温下避光孵育1520min。4.再以500800r/min离心5min,PBS缓冲液洗1次。5.加入荧光（SA-FLOUS）溶液,在4℃条件下孵育20min,避光并不时轻微振动。6.流式细胞仪分析:流式细胞仪激发光波长用488nm,用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光,另一波长大于560nm的滤器检测PI。7.结果判断:凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性,但是坏死细胞则不能。另外细胞膜有损伤的细胞的DNA也可被PI着染从而产生红色荧光,对于细胞膜保持完好的细胞,他们不会产生红色荧光。因此,在细胞凋亡的早期,PI不会着染,所以没有红色荧光信号。正常的活细胞与上述类似。在双变量流式细胞仪的散点图上,左下象限显示活细胞,为（FITC-/PI-）;右上象限是非活细胞,即坏死细胞,为（FITC+/PI+）;而右下象限为凋亡细胞,显现（FITC+/PI-）。（六）流式细胞仪进行细胞数量计数加入count eBeadsTM→选定待计数的细胞→公式计算细胞浓度。●加入*已知浓度的count eBeads进未知浓度的细胞样本●流式细胞仪同时读取细胞与count eBeads●公式计算细胞浓度如下:（?）（七）Western blotting检测蛋白表达1、提取细胞总蛋白收取5-10×106个细胞,在4℃,1000rpm条件下离心5-10分钟,小心吸取培养基,尽可能吸干,收集细胞。用冷PBS洗2遍细胞,尽可能吸干,收集细胞。每107个细胞加1ml预冷的RIPA裂解液。混匀后,在冰上震荡10-30分钟。在4℃,12000rpm条件下离心30分钟。快速将上清吸入另一预冷的干净离心管备用。2、BCA法测蛋白浓度用BCA方法进行蛋白浓度测定（1）BCA试剂的配制（1）试剂A,1L:分别称取10g BCA（1%）,20g Na2CO3·H2O（2%）,1.6gNa2C4H4O6·2H2O（0.16%）,4g NaOH（0.4%）,9.5g NaHCO3（0.95%）,加水至1L,用NaOH或固体NaHCO3调节pH值至11.25。（2）试剂B,50ml:取2g CuSO4·5H2O（4%）,加蒸馏水至50ml。（3）BCA试剂:取50份试剂A与1份试剂B混合均匀。此试剂可稳定一周。（2）标准蛋白质溶液:称取0.5g牛血清白蛋白,溶于蒸馏水中并定容至100ml,制成5mg/ml的溶液。用时稀释十倍。取96孔酶标板,按下表加入试剂。（?）（3）加入样品上述试剂加完后,准确吸取20μl样品溶液于酶标孔中,加入BCA试剂200μl,轻摇,于37℃保温30-60min,冷却至室温后,以空白为对照,在酶标仪上590nm处比色,以牛血清白蛋白含量为横坐标,以吸光值为纵坐标,绘制标准曲线。（4）测定浓度冷却到室温,用酶标仪测定546nm吸光度,根据标准曲线计算出蛋白浓度（ug/ml）。3、SDS-PAGE电泳（1）制胶配制10%或12%的分离胶,小心注入玻璃板间隙中,注意不产生气泡,并为浓缩胶留有梳齿长加1cm的空间。在从最上层缓慢加入1ml蒸馏水作为覆盖物,防止进入空气,减少氧对凝胶聚合的抑制作用。凝胶完全聚合后,倒掉覆盖的去离子水,尽可能用滤纸吸干残留液体。注入浓缩胶,插入梳子,小心避免产生气泡。浓缩胶聚合后,取出梳子,用去离子水冲洗梳孔,上下槽均加入1×电极缓冲液,检查是否泄漏。上样前用上槽缓冲液冲洗梳子孔。（2）处理蛋白样品取50ug待测蛋白质样品加入上样缓冲液,100℃煮沸5min,冷却后分装,4℃保存。（3）电泳加蛋白样品及Marker,行SDS-PAGE电泳,浓缩胶电压8V/cm凝胶,约65V,30min,染料进入分离胶后,增加电压为15 V/cm凝胶,约110V,溴酚蓝指示剂迁移到分离胶下游边缘时停止电压。4、转膜用半干蛋白转移装置将蛋白转移到硝酸纤维素滤膜（NC膜）上。将剪好的滤纸和NC膜在转膜缓冲液中浸泡30分钟。电泳结束后,切胶,在去离子水中略漂一下,用转移缓冲液浸泡数分钟。按顺序安装转移装置,依次为:阴极-3张滤纸-凝胶-NC膜-3张滤纸-阳极,精确对齐,用玻璃棒除尽气泡,接通电源,按0.65mA/cm2转移3-5小时。5、封闭将转移结束后的NC膜用PBS洗15分钟,室温温和摇动。将NC膜加入含有5%脱脂奶粉的封闭液中,4℃摇床孵育过夜。6、孵抗体封闭结束后,将NC膜转移到塑料袋中,按照0.1ml/cm2加入兔抗人SFRP5一抗（1:1000稀释）,4℃摇床孵育过夜。除去一抗,PBST洗3次,每次10分钟,室温温和摇动。按0.1ml/cm2加入鼠抗兔二抗,室温下摇床孵育2h,除去二抗,PBST洗3次,每次10分钟,室温温和摇动。7、显色参照ECL试剂盒说明书,进行ECL反应。分别取A液、B液各1ml,混匀,NC膜置于溶液中,温浴l min,夹入曝光夹中,于暗室内放胶片,不断改变曝光时间争取获得最清晰图片。（八）FITC-MIX荧光成像1将购买的FITC-MTX以一定浓度配置好后待用。2将不同细胞系肿瘤细胞计数,计算出相同细胞数,分别置于不容试管中约2ml,总细胞数约50000个。3将同体积FITC-MTX加入细胞液中孵育90分钟,4充分悬浮后取出一半细胞液,离心弃上清。另一半细胞液继续孵育24小时5 PBS冲洗,离心800rpm两遍6以PBS0.5ml重新悬浮细胞7在荧光显微镜下观测细胞内FITC-MTX发光度8计算出峰浓度9 24小时后重复5-8操作结果一、求证各种药物在两种细胞系的IC50及实验设计思路的正确性。1、采用WST1方法测定5637细胞系和T24细胞系对于MTX和PTX及PAL的IC50。结果显示对于相同的药物MTX和PTX具有不同的IC50,相对来讲T24更加敏感。PAL的IC50基本接近稳定。2、采用Western blot方法在蛋白水平进一步研究了为什么两种细胞系IC50不同。结果显示5637细胞系相对于T24细胞系可以表达较少的RFC（Reduced folate carrier protein）及较多的DHFR。因此在某种程度上解释了IC50不同的可能原因。3、采用FITC-MIX荧光成像方法。用荧光标记的MTX处理5637细胞系和T24细胞系。在90分钟及24小时时间测定吸入细胞内的药物的量。结果显示在相同的时间内T24细胞可以吸入更多的FITC-MIX进入细胞。从而可以直观的解释为什么两种细胞系IC50的不同。4、采用Western blot方法在蛋白水平进一步验证本实验思路的正确性。不同浓度PAL单药处理两种细胞系后均提示可以引起DHFR的明显下降。结果显示两种药物作用在同一细胞通路上,它们具有明显的浓度正相关。验证了本实验设计思路的正确性。二、探索单药在处理肿瘤细胞中表现的特性1、采用Western blot检测PAL处理两种细胞系后细胞DHFR表达。结果显示随着PAL浓度的增加,细胞表达DHFR明显减少。用MTX及PTX单独处理两种细胞后结果提示DHFR均明显增加,而且也是成浓度正相关。2、采用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡。结果提示MTX及PTX可以引起更多的细胞凋亡。而PAL可以引起更多的细胞停留在G1期,但是在去除PAL后细胞又可以重新进入S期,也就是是PAL只能抑制细胞的分裂,但不能引起更多的细胞凋亡。三、联合MTX或PTX与PAL最佳用药方案的研究1、采用Western blot方法,同时验证MT、PTX、PAL单药及联合用药时相关DHFR的表达。结果显示,联合用药后可以减少DHFR的表达。且PAL用药时间越长,药物浓度越大,DHFR的表达越少。2、采用流式细胞仪辅助Beads的方法直接检测药物处理后的肿瘤细胞数。结果显示在单药给药两种药物同时给药以及两种药物顺序给药等几种不同给药方式的比较下,其中先加入PAL再加入MTX或PTX能够更多的杀伤肿瘤细胞,疗效更为有效。结论1、DHFR与CDK4/6在5637及T24中在一个细胞通路上,相对于其他通路上的蛋白表达DHFR收到CDK4/6的影响更大。2、抗叶酸药物与特异性细胞周期抑制剂联合应用能够起到协同作用,增加抗叶酸药物作用。3、两种药物虽然具有协同作用,但是需要注意加药顺序才能取得更好的疗效。细胞水平实验提示先加入PAL天24小时后再加入MTX或PTX能够得到更好的药物疗效。