微丝菌特异性识别荧光探针设计制备及识别特性

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由微丝菌引起的丝状污泥膨胀是国内外城市污水生物处理系统运行中遇到的一个世界性难题。如何快速、准确对活性污泥系统中微丝菌群进行定性识别、定量分析,并对其过度繁殖趋势作出早期判断,及早有效控制污泥膨胀,将对提高工艺系统稳定性具有重要的意义。目前,对微丝菌属的原位快速定性及定量研究还相对较少。传统识别方法以镜检、污泥沉降指数(SVI)为主,该方法简单快捷,但主观误差大,定量分析存在一定的滞后性。现代分子生物学技术在微丝菌群定性、定量分析中的应用具有更高的灵敏度,特异性和样品检测的准确性,但该技术均以核酸(DNA或RNA)为识别靶点,操作方法繁杂,且技术要求高。此外探针只对单一菌种作用,且存在细胞穿透率低、荧光易褪色等缺点也限制了其应用。有机荧光染料探针作为一种安全、实用的荧光标示技术具有检测快速、用量少、无辐射等优点。本文从分子生物学角度出发,依据微丝菌属原位条件下对长链脂肪酸(LCFA)和相应的脂类有摄食专一的生理代谢特性,及其具有的超强疏水性表面,在分析其碳源分子结构的基础上,分别设计合成了以LCFA和长链烷烃修饰的基于咔唑环为母体结构的一系列特异性菁染料荧光探针。该系列探针最大激发波长在440-500nm之间,最大发射波长在570-630nm之间,且摩尔消光系数达到104数量级,量子产率在0.15-0.23之间,Stokes位移在80-130nm之间,有效避开了生物自发荧光干扰;在活性污泥系统原位条件下对微丝菌特异识别实验结果表明:荧光染料探针能在短时间内(5-20min)实现对微丝菌群简便、快速、准确的特异性识别;初步研究了荧光信号与微丝菌群表达的定量关系;且随着修饰烷烃链长度的增加,识别特异性增强本文中所制备的荧光探针将识别靶点从细胞内核酸转移到细胞外表面,避免了探针对菌丝细胞结构的破坏,解决了细胞穿透率低的缺陷;荧光探针可作用于微丝菌群,应用的覆盖面得到扩展,定量效果更佳;使建立一种简便快捷,技术要求低的微丝菌原位识别方法成为可能。
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