骨骼是人类最大的器官。骨骼的生长发育是一个复杂的过程,其生长方式主要有两种,即膜内成骨与软骨内成骨。其中软骨内成骨是躯干骨,四肢长骨,以及部分不规则短骨生长的主要方式,膜内成骨则是顶骨,额骨和锁骨等骨骼的主要形成方式。软骨内成骨在胚胎发育过程及长骨形成等方面发挥重要的作用[1],目前公认成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor,FGF)信号通路在软骨内成骨过程中发挥着重要的调控作用。成纤维细胞生长因子家族由22个成员组成,目前认为FGF2是其中表达最广泛的细胞因子。成纤维细胞生长因子通过与细胞膜上的成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast growth factor receptor,FGFR)激活下游多种通路,产生一系列效应。在小鼠模型及人类病例中,FGFR点突变能引起多种类型的侏儒。在软骨细胞中,FGF信号通路能抑制细胞增殖。目前关于FGF信号通路所影响的下游蛋白分子已有很多研究,但在软骨组织中FGF信号通路是否通过影响非编码蛋白RNA从而发挥其对软骨细胞的调控作用,尚没有得到很好的研究。近年来对非编码RNA(non-coding RNA,nc RNA)在胚胎发育,正常生理过程及疾病过程中的作用认识日益加深[5]。非编码RNA不编码成蛋白质,以其它方式发挥作用。长链非编码RNAs(Long non-coding RNAs)是指转录长度超过200个碱基对的nc RNA,在物种间保守性不高,通过多种途径调控基因的表达。Malat1是一个在哺乳动物中高度保守存在的Lnc RNA,最初在关于非小细胞肺癌的筛选性研究中被发现。之后发现几乎所有的肿瘤细胞中Malat1均有高表达,大量肿瘤学研究表明Malat1对多种肿瘤细胞具有促侵袭和促转移作用。Malat1在成骨细胞增殖,骨肉瘤增殖侵袭等方面具有促进作用,这些研究表明在骨骼中,Malat1可能发挥一定的作用,但其在软骨细胞中有无作用尚不清楚,在软骨发育过程中发挥重要作用的FGF信号是否与Malat1有联系目前也不清楚。本实验室在FGF信号通路对软骨的调控方面做了很多研究,积累了良好的基础。关于FGF信号通路所影响的下游蛋白分子已有很多研究,但在软骨组织中FGF信号通路是否通过影响非蛋白类分子,比如Lnc RNAs,从而发挥其对软骨细胞的调控作用,尚不十分清楚。因此我们首先以小鼠原代软骨细胞,小鼠软骨前体细胞系ATDC5,人类正常软骨细胞C28I2作为细胞模型,检测了Malat1在软骨细胞中的基础表达水平,我们的结果表明Malat1在小鼠和人的软骨细胞中均呈现高丰度表达,这样高的基础水平提示Malat1在软骨细胞中可能发挥着重要的生物学功能。因此在本课题中,我们利用小片段干扰RNA技术干扰了Malat1的表达水平,初步研究Malat1对软骨细胞的作用。为了探究FGF信号通路是否调控Malat1的表达,我们进一步利用重组FGF2结合相关通路阻断剂处理小鼠原代软骨细胞,小鼠及人类软骨细胞系模型,探讨了FGF2信号通路是否可以通过调控Malat1的表达调节软骨细胞增殖。主要实验方法:1.Malat1在软骨细胞中的基础表达水平1.1分离C57小鼠新生幼崽(日龄3~5日)原代软骨,接种培养48h后提取RNA,利用q PCR检测Malat1的表达水平。1.2培养小鼠成纤维细胞系NIH3T3,小鼠软骨前体细胞系ATDC5,人正常软骨细胞系C28I2,以及人骨肉瘤细胞系SW1353,24h及48h后提取RNA并检测Malat1的表达水平。2.Malat1对ATDC5软骨细胞系增殖的影响2.1设计数条针对小鼠Malat1基因的si RNA并通过荧光指示剂和q PCR筛选出最有效的si RNA。2.2将si RNA转染至ATDC5细胞并通过细胞计数研究Malat1敲减对ATDC5细胞增殖速度的影响。3.FGF2对软骨细胞中Malat1表达水平的影响3.1用FGF2处理C57小鼠原代软骨细胞,及ATDC5细胞,在处理后不同时间点提取RNA,q PCR测定Malat1的表达水平,以未处理组作为对照组。3.2用ERK通路抑制剂U0126单独或与FGF2共同处理ATDC5细胞,在处理后24h收取RNA,q PCR检测Malat1的表达水平,以未处理组作为对照组。3.3从本科室保育的β-catenin小鼠中分离原代软骨细胞并培养,48h后收取细胞并提取RNA,q PCR检测Malat1表达水平的变化,以未敲除组作为对照组。3.4从本科室保育的FGFR1 Col2阳性细胞特异性敲除小鼠及FGFR3系统性敲除小鼠中分离原代软骨细胞并培养,48h后收取细胞并提取RNA,q PCR检测Malat1表达水平的变化,以同窝未敲除幼崽作为对照组。3.5设计针对Fgfr1的si RNA,并构建和制备Myc-Fgfr1质粒,确认其工作效率后将两者转入ATDC5细胞,24h后利用q PCR技术检测Malat1表达水平的变化,以未处理组作为对照组。主要实验结果:1.Malat1在多种软骨细胞系中的表达丰度。我们首先利用q PCR检测了NIH3T3细胞中Malat1的基础表达水平,以其作为参照,结果提示Malat1在C57小鼠原代软骨细胞,小鼠软骨细胞系ATDC5,人正常软骨细胞系C28I2及人骨肉瘤细胞系SW1353中均为高丰度基础表达。在ATDC5细胞中,24h及48h时间点Malat1的基础表达水平无明显差异。2.敲减Malat1对ATDC5细胞的增殖速度的影响。用si-Malat1转染细胞,观察共转染的荧光指示剂,结果提示si-Malat1已经被成功转染到ATDC5细胞中;收取细胞RNA,利用q PCR检测,结果发现Malat1的表达水平被成功干扰,干扰效率超过50%;si-Malat1转染细胞后多个时间点进行细胞计数,以未处理组作为对照组,结果表明Malat1被干扰后,ATDC5细胞的增殖速度出现了明显下降。3.FGF信号对Malat1的调控。用FGF2处理C57小鼠原代软骨细胞,小鼠软骨细胞系ATDC5,人正常软骨细胞系C28I2及人骨肉瘤细胞系SW1353,24h后收取细胞提取RNA,进行q PCR检测。以未处理组作为对照组,结果发现在上述细胞中,FGF2处理均明显抑制了Malat1的表达水平。在ATDC5细胞中进行多浓度和多时间点FGF2处理,提取RNA后q PCR检测,结果提示FGF2对ATDC5细胞中Malat1的抑制作用无剂量依赖效应,在24h即已生效,持续时间可达24小时以上。利用本科室保育的β-catenin Col2阳性细胞特异性敲除小鼠幼仔分离原代软骨细胞培养,利用q PCR检测Malat1的表达水平,以未敲除组作为对照组,发现Malat1的表达水平未发生明显变化。利用ERK信号通路抑制剂U0126单独处理或与FGF2共同处理ATDC5细胞,收取RNA进行q PCR检测,结果表明ATDC5细胞经U0126处理后,Malat1的表达水平显著提高,且FGF2与U0126共同处理时,FGF2不能抑制Malat1的表达水平。提示FGF2对Malat1的抑制可能是通过FGF受体激活下游ERK通路完成的。利用本科室保育的FGFR1条件性敲除小鼠及FGFR3敲除小鼠幼仔分离原代软骨细胞培养,利用q PCR检测Malat1的表达水平,以未敲除组作为对照组,发现在FGFR3敲除小鼠原代软骨中,Malat1的基础表达水平未发生明显变化,同时,Fgfr3敲除的小鼠幼仔原代软骨经FGF2处理后,Malat1的表达仍然是下调的;在FGFR1条件性敲除小鼠的原代软骨中,Malat1的基础表达水平显著上升,并且在条件性敲除Fgfr1的小鼠原代软骨中,与对照组相比,FGF2处理不能再抑制Malat1的表达。与此同时,我们设计了针对Fgfr1的si RNA,并构建制备了Myc-Fgfr1质粒,将si RNA及Fgfr1质粒分别转入ATDC5细胞中,24h后收取RNA进行q PCR检测,结果提示Fgfr1表达水平被干扰后,Malat1的表达水平明显增高,同时,与FGF2处理的空白对照组相比,Fgfr1被干扰后FGF2不能有效地抑制Malat1的表达。主要结论:1.在人及小鼠的软骨细胞中Malat1的基础表达水平丰富且稳定。2.Malat1对软骨细胞的增殖具有促进作用。3.FGF信号可能通过FGFR1,激活下游ERK通路,调控Malat1的表达。