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对许多器官受损的患者来说,在诸多组织工程与再生医学的策略中,最具临床应用价值的方法便是器官内源性的原位修复及再生。器官内源性的原位修复与再生不仅需要各类细胞的增殖与分化,更需要合适的胞外微环境。而天然器官去细胞的胞外基质材料,既拥有最合适的生物相容性、生物物理特性及化学特性、完整的胞外基质成分与器官的3D结构,还拥有更优越的细胞黏附、增殖与分化的环境。因此,想要利用异体器官去细胞的胞外基质材料,尝试性探索其是否具有促进哺乳类器官内源性再生的能力。
选择卵巢器官为模型进行验证,首先获取小鼠卵巢并将其制作为去细胞的胞外基质,结合形态学观察、组织学染色分析的结果,将结构完整、无细胞残留的卵巢胞外基质移植到切除卵巢的实验组小鼠的卵巢包膜内,对照组则只进行卵巢切除手术,而不移植卵巢胞外基质,30天后观察卵巢是否可以再生。结果发现,对照组小鼠卵巢包膜内是空的,而实验组中移植的卵巢胞外基质能重新生长为卵巢。通过统计分析后发现,实验组中的552只小鼠,有205只小鼠能够再生卵巢,其卵巢再生率可达37.14%。而在对照组的118只小鼠中,没有一只小鼠可以再生卵巢。进一步从再生卵巢的形态学、组织学、免疫组织化学和功能这四个方面进行分析,其检测结果都与正常卵巢的分析、检测结果相一致,即再生卵巢与正常卵巢间形态无差异、在组织切片中可观察到各级卵泡、再生卵巢中的卵母细胞能够在体外成熟、卵巢可正常排卵及维持实验组小鼠的内分泌功能,使得实验组小鼠可以正常产生后代。为了证明卵巢再生是由卵巢胞外基质诱导再生的,利用阿尔新蓝染色液对卵巢胞外基质进行着色,并将其移植到卵巢原位,结果发现,移植阿尔新蓝着色的卵巢胞外基质只能有限地促进卵巢的再生,其再生卵巢内的卵泡较少,卵巢再生率也降至24.3%。进一步移植单一成分的人工明胶和胶原材料,根据组织学染色结果,发现只有很少的细胞能够迁移入人工材料中,并且无法形成卵泡结构。因此,可以推断天然的、未经着色处理的卵巢胞外基质在卵巢原位的再生的过程中发挥有重要的诱导作用。此外,还发现,卵巢再生的情况是广泛存在于小鼠品系内的,但将卵巢胞外基质异位移植到肾包膜下,卵巢胞外基质却不能够再生为卵巢。
为了进一步探索卵巢再生的具体过程,分别取再生2、5、8、10、15、20、25、30天的再生卵巢,对其进行形态学、组织学分析。发现随着再生时间的增加,卵巢胞外基质内会逐渐迁入更多的细胞,在15天再生卵巢的组织切片中首次发现了卵泡,并在后续的再生过程中,观察到了更多数量的卵泡。进一步选择对再生10、15、30天的卵巢和正常卵巢进行转录组分析,结果发现再生10天卵巢同再生15天卵巢的转录组的分析结果较为一致,而再生30天卵巢与正常卵巢的转录组的分析结果较为一致。在对比以上四组差异表达的基因后发现,在再生10、15天的卵巢中高表达的差异基因多聚集于免疫反应、细胞外基质重塑、血管生成、组织迁移及再生等生物学过程中,而高表达于再生30天卵巢和正常卵巢的差异基因则更多聚集于卵泡发育、排卵周期、类固醇合成及生殖发育等生物学过程中。与此同时,还进行了PCR和qPCR的验证实验,其结果同转录组检测的结果相一致。在转录组数据分析的基础上,选取再生15天卵巢和正常卵巢进行蛋白组对比分析,其分析结果与转录组的分析结果相一致。这也说明卵巢再生是一个动态变化的过程,会经历细胞迁移、组织重塑、细胞再分化等生物学过程。除此之外,还发现在卵巢再生过程中,部分卵泡是由新分化形成的卵母细胞与颗粒细胞重新组装形成的。其中新分化的卵母细胞可能来源于骨髓中的lin-c-kit+sca-1-细胞,且当lin-细胞与生殖嵴细胞共同异位移植于肾脏时,lin-细胞能分化形成簇状的卵母细胞类细胞。
综上所述,成功利用卵巢胞外基质在小鼠体内原位再生出新的卵巢。卵巢的再生是从无到有的过程,再生的卵巢不仅可以从lin-c-kit+sca-1-细胞重新分化形成卵母细胞,继而组装为新的原始卵泡,还能够执行产仔和内分泌功能。本实验为研究哺乳类原位器官的再生提供一种可能,也为进一步探讨哺乳类器官再生的机理做出了铺垫。
选择卵巢器官为模型进行验证,首先获取小鼠卵巢并将其制作为去细胞的胞外基质,结合形态学观察、组织学染色分析的结果,将结构完整、无细胞残留的卵巢胞外基质移植到切除卵巢的实验组小鼠的卵巢包膜内,对照组则只进行卵巢切除手术,而不移植卵巢胞外基质,30天后观察卵巢是否可以再生。结果发现,对照组小鼠卵巢包膜内是空的,而实验组中移植的卵巢胞外基质能重新生长为卵巢。通过统计分析后发现,实验组中的552只小鼠,有205只小鼠能够再生卵巢,其卵巢再生率可达37.14%。而在对照组的118只小鼠中,没有一只小鼠可以再生卵巢。进一步从再生卵巢的形态学、组织学、免疫组织化学和功能这四个方面进行分析,其检测结果都与正常卵巢的分析、检测结果相一致,即再生卵巢与正常卵巢间形态无差异、在组织切片中可观察到各级卵泡、再生卵巢中的卵母细胞能够在体外成熟、卵巢可正常排卵及维持实验组小鼠的内分泌功能,使得实验组小鼠可以正常产生后代。为了证明卵巢再生是由卵巢胞外基质诱导再生的,利用阿尔新蓝染色液对卵巢胞外基质进行着色,并将其移植到卵巢原位,结果发现,移植阿尔新蓝着色的卵巢胞外基质只能有限地促进卵巢的再生,其再生卵巢内的卵泡较少,卵巢再生率也降至24.3%。进一步移植单一成分的人工明胶和胶原材料,根据组织学染色结果,发现只有很少的细胞能够迁移入人工材料中,并且无法形成卵泡结构。因此,可以推断天然的、未经着色处理的卵巢胞外基质在卵巢原位的再生的过程中发挥有重要的诱导作用。此外,还发现,卵巢再生的情况是广泛存在于小鼠品系内的,但将卵巢胞外基质异位移植到肾包膜下,卵巢胞外基质却不能够再生为卵巢。
为了进一步探索卵巢再生的具体过程,分别取再生2、5、8、10、15、20、25、30天的再生卵巢,对其进行形态学、组织学分析。发现随着再生时间的增加,卵巢胞外基质内会逐渐迁入更多的细胞,在15天再生卵巢的组织切片中首次发现了卵泡,并在后续的再生过程中,观察到了更多数量的卵泡。进一步选择对再生10、15、30天的卵巢和正常卵巢进行转录组分析,结果发现再生10天卵巢同再生15天卵巢的转录组的分析结果较为一致,而再生30天卵巢与正常卵巢的转录组的分析结果较为一致。在对比以上四组差异表达的基因后发现,在再生10、15天的卵巢中高表达的差异基因多聚集于免疫反应、细胞外基质重塑、血管生成、组织迁移及再生等生物学过程中,而高表达于再生30天卵巢和正常卵巢的差异基因则更多聚集于卵泡发育、排卵周期、类固醇合成及生殖发育等生物学过程中。与此同时,还进行了PCR和qPCR的验证实验,其结果同转录组检测的结果相一致。在转录组数据分析的基础上,选取再生15天卵巢和正常卵巢进行蛋白组对比分析,其分析结果与转录组的分析结果相一致。这也说明卵巢再生是一个动态变化的过程,会经历细胞迁移、组织重塑、细胞再分化等生物学过程。除此之外,还发现在卵巢再生过程中,部分卵泡是由新分化形成的卵母细胞与颗粒细胞重新组装形成的。其中新分化的卵母细胞可能来源于骨髓中的lin-c-kit+sca-1-细胞,且当lin-细胞与生殖嵴细胞共同异位移植于肾脏时,lin-细胞能分化形成簇状的卵母细胞类细胞。
综上所述,成功利用卵巢胞外基质在小鼠体内原位再生出新的卵巢。卵巢的再生是从无到有的过程,再生的卵巢不仅可以从lin-c-kit+sca-1-细胞重新分化形成卵母细胞,继而组装为新的原始卵泡,还能够执行产仔和内分泌功能。本实验为研究哺乳类原位器官的再生提供一种可能,也为进一步探讨哺乳类器官再生的机理做出了铺垫。