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金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，S.aureus）是奶牛乳腺炎的主要病原体，可以内化进入细胞。进入细胞内的S.aureus可以适应宿主细胞的内环境从而实现定植。异噬（xenophagy）是选择性自噬的一种形式，其中胞内的细菌被自噬小体捕获，在溶酶体中降解。细菌入侵和宿主细胞通过异噬抵御细菌感染是一个病原体与宿主细胞相互作用的过程，这个过程可能存在着一个复杂的调控网络，但机制并不完全清楚。奶牛乳腺上皮细胞（bovinemammaryepithelialcells,BMECs）是奶牛乳腺的主要细胞，常被用于奶牛乳腺炎的研究。在本研究中，以BMECs作为细胞模型，通过转录组和蛋白质组分析，探究BMECs感染S.aureus后mRNA表达谱和蛋白质表达谱的变化，筛选出宿主细胞抵御细菌感染的关键分子，阐明S.aureus诱导宿主细胞异噬的分子机制。这些结果为S.aureus诱导的奶牛乳腺炎的防治提供了新思路。
实验建立BMECs胞内S.aureus感染模型，通过转录组学分析及蛋白质组学再分析筛选出S.aureus入侵相关的差异表达基因和差异表达蛋白。对筛选出的ITGAV、ACTR2、ACTR3和CI-MPR分别进行功能验证，探讨其在细菌感染中发挥的作用。通过透射电镜、免疫荧光染色等方法检测S.aureus诱导的异噬，通过转录后沉默、抑制剂处理等方法，明确CI-MPR和Clathrin在S.aureus诱导的异噬中发挥的功能。进一步，检测S.aureus侵染BMECs后，PI3K/Akt信号通路和JNK/c-Jun信号通路的活性，探讨该信号通路对CI-MPR表达及异噬的调控作用。
结果表明：
1）通过菌落计数对细胞内和细胞外的细菌进行评估，在全细胞裂解液中检出S.aureus，而在培养液中没有发现。此外，激光共聚焦显微镜下可见细胞内染色的S.aureus，透射电镜观察到S.aureus游离于BMECs细胞质中。对S.aureus侵染BMECs2h和8h分别进行转录组学分析，筛选到与细菌入侵相关的三个差异表达基因，分别为ITGAV，ACTR2，ACTR3。
2）对S.aureus侵染2h的BMECs和对照组的蛋白质组数据再分析。发现CI-MPR在KEGG数据库中被注释到溶酶体、吞噬体和内吞作用条目，预示可能参与抵御S.aureus侵染。Western blot检测，S.aureus感染的细胞中CI-MPR表达水平升高。
3）ITGAV转录后沉默和整合素（Integrin）抑制剂RGD预处理，BMECs内S.aureus的数目均显著减少，提示Integrin介导S.aureus入侵BMECs。ACTR2转录后沉默和ACTR3转录后沉默，BMECs内S.aureus的数目均显著减少，提示ACTR2和ACTR3介导S.aureus入侵BMECs。
4）CI-MPR转录后沉默和抗体封闭CI-MPR后，BMECs内S.aureus的数目显著升高；CI-MPR激动剂D-M6P处理，BMECs内S.aureus的数目显著降低。Clathrin抑制剂Pitstop2处理，BMECs内S.aureus的数目显著升高。生物信息学预测结果和免疫共沉淀结果证明CI-MPR和Clathrin具有相互作用关系，提示CI-MPR偶联Clathrin抵御S.aureus入侵BMECs。
5）S.aureus侵染BMECs后，透射电镜可见包裹着细菌的自噬溶酶体；激光共聚焦显微镜观察到S.aureus与LC3共定位，MDC阳性标记的囊泡增多；Western blot结果显示，p62和LC3的表达量增加；自噬抑制剂羟氯喹（HCQ）处理后，异噬受阻。以上结果证明，S.aureus入侵BMECs诱导异噬发生。
6）CI-MPR转录后沉默，S.aureus诱导的异噬减弱；CI-MPR激动剂（D-M6P）处理，异噬增强。网格蛋白抑制剂（Pitstop2）处理，S.aureus诱导的异噬减弱，提示CI-MPR和网格蛋白均介导S.aureus诱导的异噬。
7）S.aureus入侵BMECs，PI3K/Akt信号通路和JNK信号通路被激活。CI-MPR转录后沉默和激动剂D-M6P处理，证明CI-MPR介导S.aureus入侵BMECs诱导的PI3K/Akt信号通路和JNK信号通路激活；PI3K抑制剂LY294002和JNK抑制剂SP600125处理，证明PI3K/Akt信号通路对JNK信号通路具有调节作用。
8）生物信息学预测c-Jun是CI-MPR的转录因子。S.aureus侵袭后，JNK/c-Jun信号通路被激活，CI-MPR表达量增加。JNK抑制剂SP600125处理后，JNK/c-Jun活性受到抑制，CI-MPR表达水平下降，异噬减弱。提示JNK/c-Jun信号通路调控CI-MPR基因表达和异噬。
总之，S.aureus通过Integrin和ACTR2、ACTR3入侵BMECs并诱导异噬发生，CI-MPR和Clathrin共同抵御S.aureus入侵并介导异噬。同时，细菌入侵导致宿主细胞内PI3K/Akt信号通路和JNK/c-Jun信号通路被激活，促进CI-MPR的表达。CI-MPR/PI3K/Akt偶联JNK/c-Jun调控异噬，从而抵御细菌感染。这些结果展示了S.aureus入侵BMECs及BMECs抵御S.aureus感染的新机制，为奶牛乳腺炎的防治提供理论依据。
实验建立BMECs胞内S.aureus感染模型，通过转录组学分析及蛋白质组学再分析筛选出S.aureus入侵相关的差异表达基因和差异表达蛋白。对筛选出的ITGAV、ACTR2、ACTR3和CI-MPR分别进行功能验证，探讨其在细菌感染中发挥的作用。通过透射电镜、免疫荧光染色等方法检测S.aureus诱导的异噬，通过转录后沉默、抑制剂处理等方法，明确CI-MPR和Clathrin在S.aureus诱导的异噬中发挥的功能。进一步，检测S.aureus侵染BMECs后，PI3K/Akt信号通路和JNK/c-Jun信号通路的活性，探讨该信号通路对CI-MPR表达及异噬的调控作用。
结果表明：
1）通过菌落计数对细胞内和细胞外的细菌进行评估，在全细胞裂解液中检出S.aureus，而在培养液中没有发现。此外，激光共聚焦显微镜下可见细胞内染色的S.aureus，透射电镜观察到S.aureus游离于BMECs细胞质中。对S.aureus侵染BMECs2h和8h分别进行转录组学分析，筛选到与细菌入侵相关的三个差异表达基因，分别为ITGAV，ACTR2，ACTR3。
2）对S.aureus侵染2h的BMECs和对照组的蛋白质组数据再分析。发现CI-MPR在KEGG数据库中被注释到溶酶体、吞噬体和内吞作用条目，预示可能参与抵御S.aureus侵染。Western blot检测，S.aureus感染的细胞中CI-MPR表达水平升高。
3）ITGAV转录后沉默和整合素（Integrin）抑制剂RGD预处理，BMECs内S.aureus的数目均显著减少，提示Integrin介导S.aureus入侵BMECs。ACTR2转录后沉默和ACTR3转录后沉默，BMECs内S.aureus的数目均显著减少，提示ACTR2和ACTR3介导S.aureus入侵BMECs。
4）CI-MPR转录后沉默和抗体封闭CI-MPR后，BMECs内S.aureus的数目显著升高；CI-MPR激动剂D-M6P处理，BMECs内S.aureus的数目显著降低。Clathrin抑制剂Pitstop2处理，BMECs内S.aureus的数目显著升高。生物信息学预测结果和免疫共沉淀结果证明CI-MPR和Clathrin具有相互作用关系，提示CI-MPR偶联Clathrin抵御S.aureus入侵BMECs。
5）S.aureus侵染BMECs后，透射电镜可见包裹着细菌的自噬溶酶体；激光共聚焦显微镜观察到S.aureus与LC3共定位，MDC阳性标记的囊泡增多；Western blot结果显示，p62和LC3的表达量增加；自噬抑制剂羟氯喹（HCQ）处理后，异噬受阻。以上结果证明，S.aureus入侵BMECs诱导异噬发生。
6）CI-MPR转录后沉默，S.aureus诱导的异噬减弱；CI-MPR激动剂（D-M6P）处理，异噬增强。网格蛋白抑制剂（Pitstop2）处理，S.aureus诱导的异噬减弱，提示CI-MPR和网格蛋白均介导S.aureus诱导的异噬。
7）S.aureus入侵BMECs，PI3K/Akt信号通路和JNK信号通路被激活。CI-MPR转录后沉默和激动剂D-M6P处理，证明CI-MPR介导S.aureus入侵BMECs诱导的PI3K/Akt信号通路和JNK信号通路激活；PI3K抑制剂LY294002和JNK抑制剂SP600125处理，证明PI3K/Akt信号通路对JNK信号通路具有调节作用。
8）生物信息学预测c-Jun是CI-MPR的转录因子。S.aureus侵袭后，JNK/c-Jun信号通路被激活，CI-MPR表达量增加。JNK抑制剂SP600125处理后，JNK/c-Jun活性受到抑制，CI-MPR表达水平下降，异噬减弱。提示JNK/c-Jun信号通路调控CI-MPR基因表达和异噬。
总之，S.aureus通过Integrin和ACTR2、ACTR3入侵BMECs并诱导异噬发生，CI-MPR和Clathrin共同抵御S.aureus入侵并介导异噬。同时，细菌入侵导致宿主细胞内PI3K/Akt信号通路和JNK/c-Jun信号通路被激活，促进CI-MPR的表达。CI-MPR/PI3K/Akt偶联JNK/c-Jun调控异噬，从而抵御细菌感染。这些结果展示了S.aureus入侵BMECs及BMECs抵御S.aureus感染的新机制，为奶牛乳腺炎的防治提供理论依据。