论文部分内容阅读
目的:人食管下括约肌(LES)是食管胃接合部(esophagogastric junction, EGJ)特殊增厚的一簇肌肉组织。20世纪70年代,Liebermann-Meffert等提出LES由套索纤维(sling fibers)和钩状纤维(clasp fibers)共同构成。这两束肌纤维与膈脚协同作用以维持食管下括约肌的正常关闭状态,并在食管胃接合部形成食管下括约肌高压带。正常状态下,此高压带可防止胃内容物反流入食管,并且在适当的时候降低压力以允许食管内食团下行入胃,或使胃内液体或气体排出。食管下括约肌功能的维持主要依赖神经体液因素以及食管下括约肌自身肌源因素等共同调节,以保障吞咽舒张的同时起到抗反流的作用。钙离子(Ca2+)对食管下括约肌的收缩功能也起到很关键的作用。根据我们先前的体外实验证明,在相同乙酰胆碱(Ach)浓度(10-8 mol/L)作用时套索纤维对Ach的敏感性更高;在Ach作用、引起细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)升高的变化时,钩状纤维[Ca2+]i的变化主要是因为L-Ca通道引起的Ca2+内流引起,而套索纤维[Ca2+]i的变化主要是因为细胞内Ca2+的释放引起。三磷酸肌醇(IP3)作为细胞信号转导过程中重要的第二信使可与三磷酸肌醇受体(IP3R)特异性结合,进而引发细胞内存储的钙离子释放,导致细胞内游离的钙离子浓度升高。目前公认的存在3种IP3R亚型,即IP3R 1、IP3R 2、IP3R 3。动物及人类部分细胞研究结果表明,IP3R的3种亚型即便是在同一生命体中,因组织和细胞类型的不同而分布不同且功能存在差异。目前针对1,4,5-三磷酸肌醇受体(1,4,5- IP3R)不同亚型(IP3R 1、IP3R 2、IP3R 3)对食管下括约肌功能研究的中外文献并无记载。本实验采用激光共聚焦显微镜(LSCM)成像和蛋白印迹(Western-blot)两种方法,探讨IP3R的3种亚型在人食管下括约肌中的表达情况,并以食管环行肌(E)和胃底环行肌(G)与套索纤维(S)、钩状纤维(C)中受体蛋白的表达规律进行对比,为进一步研究三磷酸肌醇受体在人食管下括约肌收缩调节机制中的作用奠定基础,更为完善地阐述人食管下括约肌收缩功能的调节机制。方法:1选取河北医科大学第四医院2009年3月到2010年2月因中高位食管癌行食管大部切除术患者共31例。手术室采集新鲜胃食管连接部标本,锐性剥去胃贲门部及食管下段的粘膜层及粘膜下层后,制备套索纤维(S)、钩状纤维(C)、食管体部环行肌(E)和胃底环行肌(G)的肌条。2将取得的套索纤维(S)和钩状纤维(C)标本以酶解的方法制备成单细胞悬液,以Fluo-3/AM负载稀释后各平均分成两份等量的细胞悬液平铺在共聚焦专用小平皿的中央玻片上,实验组标本中加入一定量的皂角苷(saponin)溶液、肝磷酯(heparin)溶液,对照组则为相同剂量的无钙缓冲液、heparin溶液,共聚焦显微镜扫描两组标本后分别加入一定量的Ach溶液,5s后再次扫描并记录同一单细胞内钙离子荧光强度。3以膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒提取受体蛋白,BCA法蛋白定量,配平蛋白至相同浓度与体积后,应用电泳仪电泳,分离出3种IP3R受体亚型分子量大小相应的蛋白后转膜,最后应用IP3R受体亚型抗体行暗室发光与曝光检测目的蛋白的表达,并分析其条带灰度值(IOD)。结果:1激光共聚焦显微镜成像实验组细胞荧光强度在加入Ach后增高均不明显(S 8.29±5.03,C 12.98±6.24),而对照组在加入Ach后钙离子荧光强度明显增高(S 37.50±15.03,C 28.49±6.57);在加入Ach前后,套索纤维和钩状纤维两组细胞的实验组与对照组比较均有显著差异,存在统计学意义(tS= 11.944,tC=4.84,p= 0.00)。2 Western blot存在至少2种IP3R受体亚型有其相应蛋白条带的表达:一种是IP3R 1,可显影于膜蛋白与胞浆蛋白,在C、S、E、G四个部位的灰度值分别为9118.11±4733.73,8665.15±3197.56,8597.43±3624.52,9013.00±5058.29;另一种极有可能是IP3R 3,主要显影于胞浆蛋白,在C、S、E、G四个部位的灰度值分别为20686.58±9478.28,20016.14±7764.18,11200.29±10381.24,11817.99±10498.55;钩状纤维(C)和套索纤维(S)中两种受体亚型在表达量有统计学差异(FC=16.543,FS=29.628,p=0.00),食管平滑肌(E)和胃底平滑肌(G)的表达量无统计学差异(FE=1.139,p=0.309;FG=1.105,p=0.336)。结论:1 IP3R的特异性拮抗剂肝磷酯(heparin)可降低乙酰胆碱(Ach)触发的收缩时LES套索纤维和钩状纤维细胞内钙离子浓度,也从侧面证明了人LES单细胞内IP3R的存在且其功能为影响细胞内钙离子浓度;2钩状纤维和套索纤维中至少存在2种IP3R受体亚型:一种是IP3R 1,存在于细胞膜与胞浆,表达量较低;另一种极有可能是IP3R 3,主要存在于胞浆,且表达量较高;两种受体亚型在钩状纤维和套索纤维的表达有区别,钩状纤维均高于套索纤维。