论文部分内容阅读
第一部分GSPT2在肝癌组织中的表达及预后分析目的:研究GSPT2基因在肝癌及癌旁组织中的表达差异及与临床病理特征和预后的关系。方法:免疫组织化学染色检测46对肝癌组织及对应癌旁组织GSPT2基因表达量,采用H-score对GSPT2基因进行半定量分析;采用qRT-PCR及Western blot检测本室留存的3对肝癌及癌旁组织标本中GSPT2基因mRNA和蛋白表达量。SPSS21.0进行卡方检验分析GSPT2基因表达量差异与临床病理特征的关系;进行Kaplan-Meier法及Log-rank检验法分析GSPT2基因表达与总生存期(Overrall Survival,OS)和无瘤生存期(Desease-Free Survival,DFS)的关系;拟合多因素Cox模型,采用HR(Hazard Risk,HR)及95%CI估计不同临床因素与肝癌死亡结局是否有联系。挖掘TCGA数据库,分析数据库中亚洲肝细胞癌患者及正常人GSPT2基因表达量差异及与预后关系。结果:1免疫组化结果显示肝癌患者GSPT2基因表达量中位数11.36低于正常人中位数24.51(P<0.001);以免疫组化H-score中位数将肝癌患者分为低表达组和高表达组,结果显示GSPT2基因肝癌低表达组表达量中位数4.47明显低于癌旁组织中位数24.51(P<0.001),肝癌高表达组表达量中位数25.14与癌旁组织中位数24.51无统计学差异(P=0.179)。2肝癌组织GSPT2基因表达量与临床病理特征的关系,结果显示肝癌组织中GSPT2的表达水平与患者年龄,性别,肿瘤直径,肝硬化,有无转移,TNM分期,术前AFP水平,HBsAg感染均不相关;而与肿瘤数量相关(P=0.044),肿瘤数量越少,GSPT2表达水平越低。3肝癌与癌旁组织qRT-PCR实验结果显示,在肝癌组织中GSPT2基因mRNA表达量(1.00±0.34)低于癌旁组织(5.16±2.27)(t=-2.971,P=0.041);Western blot结果显示,肝癌与癌旁组织GSPT2蛋白相对表达量分别为0.85±0.03,1.00±0.04,癌旁表达量高于肝癌(t=4.800,P=0.009)。4肝癌患者低表达组和高表达组生存分析,结果显示低表达组中位OS(652.00)长于高表达组(597.00)(Z=4.021,P=0.045);低表达组中位DFS(434.00)长于高表达组(327.00)(Z=4.539,P=0.033)。5 Cox回归模型多因素分析影响肝癌预后的因素,结果显示临床病理特征中TNM分期(4.236(1.908-10.170))、肿瘤数目(2.557(1.232-5.303))是影响OS独立预后因素;而TNM分期(4.249(1.895-9.526))是影响DFS独立预后因素。6生物信息学分析结果显示亚洲肝细胞癌患者(155例)GSPT2mRNA表达量明显低于正常人(10例)(Z=-2.961,P=0.003);根据肝癌患者GSPT2 mRNA表达量中位数186.00分为GSPT2高表达组和低表达组,肝癌患者低表达组GSPT2基因表达量(29.00)明显低于正常人(537.50)(P<0.001),而高表达组GSPT2基因表达量(444.00)与正常人差异无统计学意义(P=0.545);将肝癌患者表达量进行Kaplan-Meier生存分析,结果证明GSPT2 mRNA高表达与肝癌不良预后相关(P=0.002)。结论:1 GSPT2基因在细胞胞质中表达,且肝癌患者肝细胞表达量低于正常人。2肝癌患者GSPT2基因表达量与患者年龄、性别、肝硬化、有无转移等临床病理特征均无关,而与肝脏肿瘤数量相关。3 GSPT2基因高表达与肝癌不良预后相关。第二部分过表达GSPT2基因对肝癌细胞生物学功能的影响研究目的:构建GSPT2基因稳定过表达的HepG2肝癌细胞,研究稳定过表达GSPT2基因对HepG2肝癌细胞生物学功能的影响。方法:提取过表达GSPT2基因的质粒,分别转染7402肝癌细胞和HepG2肝癌细胞,qRT-PCR检测转染后细胞内GSPT2基因mRNA表达量,转染48h后流式细胞术检测细胞周期的变化;划痕实验检测细胞划痕迁移能力差异。构建GSPT2基因稳定过表达的HepG2肝癌细胞,实时荧光定量和蛋白印迹法检测GSPT2基因mRNA和蛋白的表达情况;用CCK8法检测细胞活力来验证细胞增值能力变化;流式细胞术检测GSPT2基因过表达后细胞周期和凋亡能力变化;Transwell细胞侵袭实验来检测侵袭能力变化;细胞划痕实验来检测细胞迁移能力的变化。结果:1瞬时转染48h收取细胞qRT-PCR结果显示GSPT2基因在7402肝癌细胞和HepG2肝癌细胞中表达较对照组高(P<0.001),证明7402和HepG2肝癌细胞GSPT2过表达质粒转染成功。流式细胞术检测细胞周期结果显示7402肝癌细胞过表达GSPT2组与对照组相比G1期比例无差别,S期比例由44.33%上升至46.50%(P=0.004)。同时HepG2肝癌细胞过表达GSPT2组与对照组相比G1期由57.99%下降至54.56%(P=0.006),S期比例由28.28%上升至33.59%(P=0.001)。细胞划痕结果显示:GSPT2过表达质粒瞬时转染后细胞划痕迁移率(47.67±8.26)高于对照组(28.80±7.44)(P=0.042)。2成功构建稳定过表达GSPT2基因的HepG2肝癌细胞,qRT-PCR结果显示过表达组GSPT2基因mRNA表达量(22.5±2.92)较对照组(1.00±0.08)升高22.5倍(P<0.001);Western Blot结果显示,GSPT2蛋白水平在过表达组明显高于对照组(P<0.05)。3 CCK8实验检测细胞活力。结果显示:24h开始,稳定过表达GSPT2组吸光度值高于对照组,说明过表达组细胞活力增加(P=0.028)。4流式细胞术检测细胞周期。结果显示:稳定过表达GSPT2组较对照组G1期比例从51.52%下降至39.53%,S期比例较对照组由27.03%增至39.71%(P<0.05)。5流式细胞术检测细胞凋亡。结果显示:稳定过表达GSPT2组凋亡率(1.00±0.12)较对照组(6.00±1.23)下降(P<0.05)。6 Transwell侵袭实验检测各组细胞侵袭能力。结果显示:稳定过表达GSPT2后,侵袭至小室下面的细胞数为428.75±24.53,对照组细胞数为296.75±12.69,稳定过表达GSPT2组细胞转移数量增加,细胞侵袭力增强(P<0.001)。7划痕实验检测细胞迁移能力。结果显示:稳定过表达GSPT2组细胞划痕迁移率(25.00±6.00)显著高于对照组(9.70±6.87)(P<0.001)。结论:1瞬时转染GSPT2过表达可促进HepG2肝癌细胞周期,增加细胞迁移能力。2稳定转染GSPT2过表达慢病毒可成功构建GSPT2过表达的HepG2肝癌细胞。3 HepG2肝癌细胞稳定过表达GSPT2可促进细胞增殖、周期,还可以增加肝癌细胞迁移和侵袭能力,同时抑制凋亡。