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鱼类作为低等脊椎动物,其获得性免疫尚不完善,鱼类先天性免疫在外界刺激及病原微生物侵袭的防御反应中起着至关重要的作用。作为先天性免疫中重要的模式识别受体（pattern recognition receptors,PRRs）,Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）能特异性地识别微生物相关分子模式进而引发免疫应答反应。其中,TLR5能够识别细菌鞭毛蛋白进而诱导机体产生炎症反应。目前,鱼类TLR5配体识别及其信号传递机制研究仍缺乏。本研究从CiTLR5a、CiTLR5b与配体识别及其信号通路进行解析,主要结果如下:1.CiTLR5a、CiTLR5b形成同源二聚体感知鞭毛蛋白,异源二聚体感知dsRNA构建CiTLR5a-GFP、CiTLR5b-GFP、CiTLR5a-RFP、CiTLR5b-RFP、CiTLR5a-HA、CiTLR5b-HA载体,分别转入FHM细胞中,共聚焦拍照和Co-IP结果表明CiTLR5a、CiTLR5b既能形成同源二聚体,也能形成异源二聚体。随后通过qRT-PCR、ELISA、pull-down和双荧光素酶报告实验,发现CiTLR5a、CiTLR5b能够识别鞭毛蛋白和dsRNA,CiTLR5a、CiTLR5b形成异源二聚体感知鞭毛蛋白激活NF-κB反应,CiTLR5a同源二聚体感知dsRNA微弱抑制IFN反应,而CiTLR5b同源二聚体感知dsRNA促进IFN反应。2.CiTLR5a、CiTLR5b在病毒免疫反应中起拮抗作用将CiTLR5a-GFP、CiTLR5b-GFP及其干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）,分别转染草鱼幼鱼和草鱼肾细胞系（Ctenopharyngodon idella kidney,CIK）。在草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus,GCRV）和嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的感染下,分别检测了CIK细胞中病毒的含量以及病毒对细胞的损伤情况。通过双荧光素酶报告实验、空斑实验、TCID50、病毒滴度、MTT法、细胞水平和个体水平干扰、Immunoblotting分析发现CiTLR5a与CiTLR5b在识别dsRNA反应中起拮抗作用。CiTLR5a微弱抑制抗病毒反应,CiTLR5b促进抗病毒反应。3.CiTLR5a、CiTLR5b识别鞭毛蛋白位点保守,而识别dsRNA位点具有序列差异性和物种差异性首先构建CiTLR5a、CiTLR5b嵌合体,双荧光素酶报告实验结果显示CiTLR5a、CiTLR5b胞外结构域对配体识别和信号调控起决定性作用。根据斑马鱼TLR5b与鞭毛蛋白的晶体结构,选取CiTLR5a、CiTLR5b中保守的两个位点分别进行突变,pull-down和双荧光素酶报告实验结果显示CiTLR5a、CiTLR5b突变位点均与鞭毛蛋白结合能力降低及其信号传递减弱。该结果表明CiTLR5a、CiTLR5b与斑马鱼TLR5b识别鞭毛蛋白的位点高度保守。进一步对CiTLR5a、CiTLR5b识别dsRNA的关键位点进行预测并突变,pull-down和双荧光素酶报告实验结果显示CiTLR5a-G240A、CiTLR5b-N547A均与dsRNA结合能力降低。该结果表明CiTLR5a、CiTLR5b识别dsRNA的位点具有差异性。4.CiTLR5a、CiTLR5b的N-糖基化修饰影响其功能Immunoblotting检测发现CiTLR5a、CiTLR5b条带均比其理论值偏大,用糖苷酶Endo H处理后,CiTLR5a、CiTLR5b大小均降低到理论值100 kDa。衣霉素（糖苷转移酶抑制剂）处理转染了CiTLR5a、CiTLR5b的FHM细胞,双荧光素酶报告实验结果显示其功能均消失。进一步对CiTLR5a、CiTLR5b的N-糖基化位点进行预测并定点突变,双荧光素酶报告实验结果显示CiTLR5a-T101I能够促进IFN1启动子活性,CiTLR5b-I99T降低IFN1启动子活性。CiTLR5a与CiTLR5b之间的差异性N-糖基化位点不影响NF-κB启动子活性。采用pull-down分析差异性N-糖基化位点与配体的结合能力,结果显示CiTLR5a、CiTLR5b差异性N-糖基化位点对鞭毛蛋白和dsRNA的结合无显著性影响。5.鲤科鱼类TLR5能够感知dsRNA选取雀鳝、斑马鱼、斑点叉尾鮰、虹鳟、人源TLR5分别构建载体,将上述质粒转入FHM细胞中,分别在酸性（p H 5.0）和中性（p H 7.4）条件下与鞭毛蛋白Fla C和poly（I:C）进行pull-down分析,结果发现仅有斑马鱼TLR5a、TLR5b能够同时识别poly（I:C）和鞭毛蛋白并产生免疫应答反应,而其它物种来源的TLR5仅仅识别鞭毛蛋白。这些结果共同表明鲤科鱼类TLR5（TLR5a与TLR5b）能够同时识别鞭毛蛋白和dsRNA。上述结果表明CiTLR5a、CiTLR5b均能够识别鞭毛蛋白和dsRNA,CiTLR5a、CiTLR5b形成异源二聚体对鞭毛蛋白进行信号响应,CiTLR5a、CiTLR5b分别形成同源二聚体对dsRNA进行信号响应并在抗病毒免疫反应中起拮抗作用。这是首次系统阐述鱼类TLR5配体识别及其免疫调控机制。这些结果将拓展对TLR免疫调节功能的认识以及为比较免疫学研究提供重要的理论基础。