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黄颡鱼是我国重要的特色淡水鱼之一,具有较高的营养价值和经济价值。据《中国渔业统计年鉴》报道,2020年黄颡鱼年养殖产量高达56.5万吨;推测黄颡鱼的苗种年需求量约300亿尾,母本需求量很大。目前,黄颡鱼苗种繁育场的母本主要来源于向养殖户收购或捕捞野生黄颡鱼。由于全雄黄颡鱼和杂交黄颡鱼（黄颡鱼♀×瓦氏黄颡鱼♂,杂交不育）具有明显的生长优势和价格优势,养殖户养殖普通黄颡鱼的热情不高,导致黄颡鱼母本缺乏十分严重,近两年母鱼价格上升到最高约40元每斤。此外,大多数黄颡鱼苗种场的母本没有经过系统选育且非常混杂。因此,培育全雌黄颡鱼配套系,对黄颡鱼产业具有重要意义,而通过性逆转技术获得高质量XX伪雄黄颡鱼是最关键一步。本研究探索了使用不同性别控制方法创制XX伪雄黄颡鱼,并比较不同伪雄黄颡鱼和普通雄鱼的精子活力和繁殖性能差异来评估其质量。此外,我们从XX伪雄黄颡鱼和YY超雄黄颡鱼中分离出成熟的X和Y精子,进行转录组和全基因组DNA甲基化分析以期获得X精子和Y精子特异的分子标记,为快速分离X精子和Y精子及性控育种创新提供理论基础。1.来曲唑诱导促使黄颡鱼从遗传型性别决定向温度依赖型性别决定短暂转换首先,我们探索了高温处理对黄颡鱼性腺分化的影响。研究结果表明:XX黄颡鱼在高温处理期间（孵化后7-60天,34℃处理）的性腺发育会受到抑制并慢于常温处理组,而高温组黄颡鱼被转移至常温后卵巢发育恢复正常。因此,高温处理XX黄颡鱼不会诱导发生性逆转,黄颡鱼为稳定的遗传型性别决定类型。芳香化酶抑制剂处理是目前较为普遍且有效的诱导伪雄鱼的一种方法,我们探究了来曲唑（芳香化酶抑制剂）对黄颡鱼性别分化的影响,1000μg/kg来曲唑（LZ）处理会诱导39%的XX黄颡鱼逆转为生理雄性（命名,XXm-LZ）,但其精小叶结构与XY雄性相比显得短粗。我们进一步使用1000μg/kg来曲唑联合高温共同处理,约78%的XX黄颡鱼被诱导逆转为生理雄性,其精小叶表型和XXm-LZ相似。有趣的是,XXm-LZ和XX雌性黄颡鱼交配的后代在常温养殖环境下均发育为雌性,而高温养殖环境下部分个体逆转为生理雄鱼;随着处理温度和时间的增加,其性逆转的比率逐渐增加,其中34℃高温处理且时间为7-60dph条件下,99%的实验鱼逆转为XX伪雄黄颡鱼,其精小叶结构与XY雄性相似（命名,XXm-HT）。因此,人工诱导性逆转促使黄颡鱼从遗传型性别决定转换为温度依赖型性别决定。我们进一步研究该遗传和温度依赖型性别决定转换是否为永久性的,将XXm-HT与普通XX雌性黄颡鱼繁殖的子代进行高温处理。XXm-HT的子代性腺为无精小叶的细线状异常性腺,HE染色结果发现绝大多数个体性腺中的生殖细胞没有明显分化。免疫荧光分析发现雄性相关蛋白Pfpdz1和Dmrt1在高温组的XXm-HT子代性腺中生殖细胞和XY精巢中精原细胞和精母细胞中表达。生殖细胞标记蛋白Vasa在XXm-HT子代的生殖细胞正常表达;减数分裂标记蛋白Sycp3在XY精巢中精原细胞和精母细胞中正常表达,在高温组的XXm-HT子代性腺中未见表达。表明高温处理使XXm-HT子代性腺中生殖细胞雄性化但减数分裂受阻。2.不同性逆转方法创制的伪雄黄颡鱼的精巢质量和繁殖性能比较分析XXm-LZ和XXm-HT伪雄黄颡鱼的质量如何?我们将其精子活力参数和繁殖性能与正常XY雄性黄颡鱼（XYm）进行对比分析。XXm-HT的受精率、孵化率和苗种存活率均接近XYm黄颡鱼,显著高于XXm-LZ。XXm-HT子代的苗种畸形率（10.21%）显著低于XXm-LZ（30.71%）。精子活力分析结果显示XXm-HT的总运动精子比例、直线运动速度、曲线运动速度和平均运动速率等参数均接近XYm且显著高于XXm-LZ。此外,与精子活力负相关的mi R-200家族成员（mi-R141/-200a/-429b）在XXm-HT和XYm精巢中的表达量均显著低于XXm-LZ。双荧光素酶系统验证dmrt1基因是mi R-429b靶基因之一。雄性分化相关基因dmrt1和pfpdz1在XY个体和XXm-HT精巢中的表达显著高于XXm-LZ。以上结果从精子生理及基因表达水平证实XXm-HT比XXm-LZ具有更好的繁殖性能和精子活力。3.黄颡鱼X精子和Y精子的转录组和全基因组DNA甲基化比较分析常规的性别控制技术存在性逆转不彻底和育种周期长等问题。在少数哺乳动物中,利用X精子和Y精子表面特异性抗原进行流式细胞筛选或利用TLR7/8配体影响两种精子运动速度达到性别控制,而鱼类中尚未报道。为了寻找高效筛选X和Y精子特异的分子标记,我们从XX伪雄黄颡鱼和YY超雄黄颡鱼的精巢中分离成熟X和Y精子,利用RNA-seq技术分析两种精子的差异。480个基因在X精子高表达,其中ccdc173、spink1、kcnip3和clec4m基因以及4个长链非编码RNA在X精子特异表达;2574个基因在Y精子高表达,其中mrc1、rt1、ca10和apela以及2个长链非编码RNA在Y精子特异表达。对X和Y精子的差异基因分别进行功能注释发现:在X精子中许多条目与离子通道信号通路相关;在Y精子中许多条目与响应细菌成分相关,其中Toll受体家族成员TLR5在Y精子中的表达量是X精子的10倍,Toll受体家族其他成员则没有明显变化。通过对X和Y精子绘制的全基因组DNA甲基化图谱揭示:X精子的超甲基化水平比Y精子高,表明Y精子更活跃。将差异表达基因与差异甲基化基因进行联合分析,发现12.51%的Y精子高表达基因（322个基因）和11.25%的X精子高表达基因（58个基因）存在去甲基化现象。然而,X精子和Y精子特异表达的基因和长链非编码RNA,以及TLR5基因均没发生甲基化,可能存在其他转录调控方式。综上所述,我们利用来曲唑诱导黄颡鱼从遗传型性别决定向温度性别决定转换的遗传机制获得具有优良精子质量和繁殖性能的高质量伪雄黄颡鱼,显著降低了全雌黄颡鱼苗畸形率。此外,对黄颡鱼X和Y精子转录组和DNA甲基化组的比较分析,挖掘出了X和Y精子中特异表达的基因和长链非编码RNA,以及差异表达基因如TLR5,为鱼类X和Y精子的遗传分选及性控育种技术创新提供理论基础。