【摘 要】
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病毒感染导致我国水产养殖业遭受重大经济损失,目前大部分水生动物病毒的致病机理尚不明确,也尚未建立有效的防治措施。Micro RNA（miRNA）是一类小分子的非编码RNA,在病毒感染宿主的过程中发挥着不可忽视的调控作用。前期研究表明乌鳢水泡病毒（snakehead vesiculovirus,SHVV）和鲤疱疹病毒3型（cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3）感染均可造成宿主体
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病毒感染导致我国水产养殖业遭受重大经济损失,目前大部分水生动物病毒的致病机理尚不明确,也尚未建立有效的防治措施。Micro RNA（miRNA）是一类小分子的非编码RNA,在病毒感染宿主的过程中发挥着不可忽视的调控作用。前期研究表明乌鳢水泡病毒（snakehead vesiculovirus,SHVV）和鲤疱疹病毒3型（cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3）感染均可造成宿主体内miRNA的差异性表达,过表达差异性miRNA均可有效调控病毒的增殖。因此,本研究拟对miRNA在上述病毒入侵过程中的具体调控机制进行研究,包括:（1）研究miR-214通过靶向病毒或宿主基因,抑制SHVV增殖的调控机制。本研究对SHVV感染条纹月鳢（SSN-1）细胞后miR-214的表达水平进行定量检测,结果表明SHVV感染导致miR-214下调表达,且存在时间和剂量依赖性。转染miR-214类似物可抑制SHVV增殖,而转染miR-214抑制剂则促进SHVV增殖,表明miR-214是SHVV增殖的负调节因子。通过序列分析发现SHVV的n和p基因是miR-214的潜在靶基因,随后被双荧光素酶报告基因实验所证实。将miR-214类似物或抑制剂与N、P蛋白的真核表达质粒共转染SSN-1细胞,通过检测N和P蛋白的表达水平发现miR-214显著抑制N、P蛋白的表达,并且过表达N或P蛋白都可以回补miR-214对SHVV增殖的抑制。进一步研究结果表明,过表达P蛋白可抑制SHVV感染所诱导的干扰素（IFN）-2的表达,并且过表达miR-214可回补P蛋白对IFN-2的抑制效果。总而言之,这些结果都表明了鱼类细胞miR-214在SHVV感染过程中下调表达,下调的miR-214又可促进病毒N和P表达并进一步导致细胞IFN-2的下调表达,从而促进SHVV增殖。本研究通过转录组测序,从表达异常的基因中找出并验证了AMP依赖的蛋白激酶（adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase,AMPK）为miR-214的靶基因。同过表达miR-214类似物一样,敲降AMPK可以抑制SHVV的增殖,同时上调表达IFN-2,而且细胞内低表达的miR-214可回补AMPK下调表达对病毒增殖的抑制效果,上述结果表明miR-214可靶向AMPK从而抑制SHVV的增殖。（2）研究miR-155/miR-722分别通过靶向宿主和病毒基因调控CyHV-3增殖的调控机制对CyHV-3感染的CCB细胞进行miRNA高通量测序分析表明病毒感染可上调miR-155/miR-722的表达。过表达miR-155/miR-722可有效抑制CyHV-3的增殖,表明miR-155/miR-722是CyHV-3增殖的负调节因子。通过序列分析发现AMPK为miR-155的潜在靶基因,随后也得到双荧光素酶报告基因实验的证实。过表达miR-155可抑制AMPK的表达,同时可促进由病毒感染激活的IFN上调表达,而IFN的表达又可以被AMPK所抑制。因此我们提出了一个模型:CyHV-3的感染上调表达miR-155,miR-155的上调抑制AMPK的表达从而促进宿主IFN的表达,最终抑制CyHV-3的增殖。相关实验证实了病毒ORF89蛋白是miR-722的靶蛋白。将miR-722与ORF89的真核表达质粒共转染CCB细胞,通过检测荧光数量及病毒蛋白的表达水平发现miR-722显著抑制ORF89的表达,ORF89的过表达又可以显著降低IFN和干扰素刺激基因（ISG）的表达,而且过表达miR-722可回补由ORF89介导的IFN的抑制效果,通过进一步研究发现,ORF89与IRF3可相互作用并降解IRF3,还可通过抑制IRF3的二聚化来抑制IRF3进入细胞核。因此我们提出:CyHV-3的感染上调表达miR-722,miR-722的上调抑制了病毒蛋白ORF89的表达从而促进了IRF3的表达以及二聚化入核,最终上调了IFN的表达并抑制了CyHV-3的增殖。本研究对了解SHVV及CyHV-3的致病机理和研制新型抗SHVV/CyHV-3的药物具有重要的意义。同时也为micro RNA在调控水生病毒方面的研究提供了思路和可靠的理论基础。
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