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氧气是哺乳动物细胞进行正常新陈代谢不可或缺的物质,活细胞中多种生化反应必须在足够的氧气浓度下才能够顺利进行。近年来,缺血/缺氧性心血管疾病发病率呈上升趋势,如急性心肌梗塞、心绞痛等,缺血/缺氧性心血管疾病造成的心脏内环境低氧会引起心肌细胞凋亡。miRNAs是一类广泛存在真核细胞中的内源性非编码RNA,主要通过介导mRNA降解或者抑制翻译调控靶基因表达。Exosome是活细胞分泌的直径约1OOnm的囊泡结构,能够作为信号介导因子传递胞质成分(如mRNA、miRNA、蛋白质)从而在细胞交流中发挥重要作用。近年来研究发现不同类型的心脏细胞能够分泌富集miRNA的exosome,参与心脏多种生理或病理过程。本研究以H9c2细胞作为实验材料,构建体外心肌细胞低氧模型,通过small RNA-seq鉴定低氧引起的H9c2细胞及其分泌的exosome miRNA转录组差异,挖掘心肌细胞低氧适应性相关miRNA,并通过miRNA过表达与抑制验证候选miRNA在心肌细胞低氧适应性中的潜在功能,以期为缺血/缺氧性心血管疾病检测治疗和动物抗低氧分子育种提供基础资料。本研究主要结果如下:(1)低氧应激能够抑制H9c2细胞活性,破坏细胞膜完整性,诱导细胞凋亡。(2)通过small RNA-seq技术,本实验分别从常氧和低氧H9c2细胞中鉴定出338、331种成熟体miRNA,其中二者共表达miRNA有316种;以miRNA表达量Fold-change<0.5或>2为标准,筛选出92个差异表达miRNA,通过与前人报道的hypoxamiR对比,发现有31个hypoxamiR显著存在于低氧H9c2细胞差异表达miRNA中。(3)利用超高速离心法从常氧和低氧H9c2细胞培养液中分离纯化exosome,NTA分析发现粒径分布于50-200nm,这与典型的exosome粒径分布特征相似,另外,低氧后exosome浓度明显增加,说明环境应激(如低氧)可以促进细胞exosome分泌;利用small RNA-seq技术分别从常氧和低氧H9c2细胞产生的exosome中鉴定出74、144种成熟体miRNA,显示低氧明显改变exosome中miRNA种类。(4)以miRNA表达量Fold-change<0.5或>2为标准,在exosome中筛选出62个差异表达miRNA,这些miRNA在低氧细胞exosome中全部上调,且存在25个已知的hypoxamiR;表达量Top 12 miRNA排序显示低氧对高丰度miRNA种类影响不大,但显著改变了这些miRNA表达水平;通过DIANA功能富集分析发现exosome中差异miRNA主要参与到HIF-1信号通路和细胞凋亡相关通路,如Hippo信号通路、mTOR信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路。(5)已知抗凋亡miRNA(miR-21-5p、miR-378-3p)过表达和抑制实验结果与前人研究一致,证明本实验低氧模型的可行性及small RNA-seq的准确性;过表达抑制新发现的潜在抗凋亡 miRNA(miR-152-3p、let-7i-5p)显示,miR-152-3p、let-7i-5p 能够抑制低氧对H9c2细胞的伤害,缓解低氧诱导的细胞凋亡。(6)通过双荧光素酶报告系统证明Atg12和Faslg分别为miR-152-3p和let-7i-5p凋亡相关靶基因;miRNA过表达和抑制实验显示miR-152-3p和let-7i-5p分别通过抑制凋亡相关的靶基因Atg12和Faslg,进而影响线粒体途径和死亡受体途径从而缓解低氧引起的H9c2细胞凋亡。综上所述,本研究发现低氧下H9c2细胞的exosome中搭载了许多心肌保护性miRNA,它们能够缓解低氧引起的细胞凋亡改善细胞低氧适应性。另外,本研究第一次发现miR-152-3p和let-7i-5p在低氧H9c2细胞exosome中富集,分别作用于线粒体途径和死亡受体途径从而抵抗低氧损伤缓解细胞凋亡。