研究目的在中医理论指导下,研究活血降糖饮对2型糖尿病模型大鼠的糖脂代谢、胰岛素抵抗和肠道菌群稳态的调控作用及具体机制;通过对活血降糖饮主要活性化学成分的检测分析,并进一步探讨其对2型糖尿病大鼠的糖脂代谢和胰岛素抵抗的影响;此外,通过“HPLC-MS及药效验证”建立活血降糖饮(冻干粉)质量控制标准以确保多次研究结果的可重复性。材料和方法本研究主要包括活血降糖饮对2型糖尿病大鼠的糖脂代谢、胰岛素抵抗和肠道菌群稳态的作用及其机制研究和活血降糖饮质量控制标准研究。1、SPF级雄性的Wistar大鼠52只,7周龄,体重150±20g,适应性喂养7天后,按照体重随机分为正常组和造模组,正常组大鼠10只,其余造模组,正常组大鼠给予普通标准饲料喂养,造模组给予高脂饲料(D12492,60%脂肪)喂养。在4周末禁食不禁水12小时后给予造模组大鼠腹腔注射2%链脲佐菌素(streptozocin,STZ)(35mg/kg)(溶解于PH=4.4的无菌柠檬酸钠缓冲液),正常组大鼠注射等体积的0.1mol/L柠檬酸缓冲液。分别在注射STZ 3d、7d、14d采用血糖仪测定大鼠的空腹血糖(大鼠禁食12小时)。造模组大鼠空腹血糖在11.1--33.3mmol/L之间,且在14d后相对稳定的大鼠被认为造模成功,纳入研究;将造模组大鼠按体重和空腹血糖随机分为5组(n=10):模型对照组(Mod)、二甲双胍组(Met)、活血降糖饮低剂量组(HXJTL)、活血降糖饮高剂量组(HXJTH)。另设正常对照组(Norn=10只)。正常和模型对照组的大鼠给予双蒸水灌胃,剂量为5ml/kg b.w;二甲双胍组大鼠给予二甲双胍(90mg/kg);活血降糖饮低剂量组给予活血降糖饮冻干粉1.25g/kg,活血降糖饮高剂量组给予活血降糖饮冻干粉5g/kg。每日灌胃给药一次,连续给药8周。2、每日观察记录大鼠的状态和更换垫料,每周记录大鼠体重一次,每3天记录一次摄水摄食量。每周采用经割尾法采集大鼠尾部静脉血,用罗氏血糖仪测量空腹血糖(禁食12小时)并记录;在给药8周末,所有大鼠禁食不禁水12小时后,进行口服糖耐量试验(OGTT),给予2g/kg葡萄糖溶液灌胃,分别在0、30、60、120分用血糖仪用血糖仪测尾静脉血糖。3、分别在给STZ造模前时间点(-4w)、STZ造模后给药干预治疗前(0w)、给药治疗8周结束前(8w)采集大鼠肠道粪便,采用TIANamp Stool DNAKit试剂盒提取肠道粪便中的肠道菌群基因组DNA,使用Illumina Miseq基因测序平台对肠道粪便中所有微生物的16S rRNA的V4区域进行DNA测序,并进行相关分析肠道菌群物种的丰度和多样性。4、药物干预结束后,采集大鼠血液和摘取大鼠胰腺、肝脏、骨骼肌、肾脏等组织;酶标法检测大鼠的血脂谱(TG、TC、LDL-c、HDL-c)水平、血清肌酐、尿素氮、SOD、MDA,以及糖原合成酶、己糖激酶等活性酶水平;ELISA发检测大鼠的空腹胰岛素、血清瘦素、脂联素、TNF-α等;采用蒽酮法检测肝脏的肝糖原、骨骼肌的肌糖原、血清游离脂肪酸等;HE染色和免疫组化染色检测胰腺组织的病理变化;TUNEL法检测胰腺组织胰岛细胞的凋亡;Western blot法检测肝脏组织P-ACC、P-AKT蛋白和骨骼肌PI3K、AKT、P-ACC、GLUT4蛋白的表达。Western blot法检测胰腺组织相关凋亡蛋白。5、通过HPLC-MS方法测定活血降糖饮中主要活性成分,将含量最高的两个活性成分(梓醇和羟基红花黄色素A)也通过对2型糖尿病大鼠进行验证实验,具体方法同前。6、此外,采用2015年版的《中药药典》规定作为中药成分质量检测标准,以HPLC法检测不同加工提取工艺制备的活血降糖饮药液成分,优化活血降糖的提取工艺。在优化加工工艺的基础上,通过中药成分数据库挖掘出活血降糖饮中所具有的已知活性成分,然后结合现有数据库中存在的最可能具有代谢调控作用的主要活性成分,筛选出22种主要活性成分;采用HPLC-MS的方法对这22个主要活性成分进行检测作质量控制,并将这一标准制备成的活血降糖饮(冻干粉)在T2DM模型大鼠上进行药效预验证,最后将这一验证显效的中药复方一系列制备工艺标准作为活血降糖饮研究用药的质量控制标准。研究结果1、高脂饲料喂养4周加小剂量(35mg/kg)一次性腹腔注射建立的2型糖尿病大鼠与人类2型糖尿病类似,都存在明显的胰岛素抵抗、多饮多尿和血脂代谢紊乱等;造模成功率超过90%,且模型组的大鼠全程空腹血糖趋于平稳;活血降糖饮可以显著降低2型糖尿病大鼠的能量和水的摄入,尽管没有对体重产生过大的影响;在干预8周后,低剂量和高剂量的活血降糖饮组的空腹血糖分别下降54.83%和56.16%,显著高于模型组(P<0.05);给药组的OGTT曲线下面积也显著低于模型组(P