O₂、·OH和H2O2是细胞新陈代谢的不可逆产物，它们和脂质过氧化的不稳定中间体统称为ROS。ROS在机体中的过度积累将引发许多疾病，如白内障、克山病、心脑血管疾病、衰老甚至是死亡。为了清除多余的活性氧，机体进化了一套完善的抗氧化防御体系，从而维持体内活性氧的代谢平衡。谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase, GPx）作为这一体系中的明星分子，是机体内重要的抗氧化蛋白酶。但是天然GPx具有异源表达困难、易水解以及半衰期短等缺点，使得它作为一种优良的抗氧化药物受到了很大的限制，因而设计合成具有GPx功能的抗氧化酶模拟物受到科学工作者们的广泛关注。天然GPx的催化中心是被称为第21种氨基酸的硒代半胱氨酸（SeCys）,基于对这一催化中心以及催化微环境的模拟，许多GPx模拟物相继诞生。但是，由于硒代半胱氨酸中的硒是以硒醇形式存在的，在空气中相对不稳定，易酸解，于是本论文选择了结构更为稳定的硒代甲硫氨酸（SeMet）作为模拟物的催化中心，利用大肠杆菌甲硫氨酸营养缺陷型表达体系，考虑到底物结合与分子催化双重因素的影响，设计并制备了以谷胱甘肽转硫酶为骨架的高效GPx模拟物。另外，尽管活性氧涉及到机体的许多疾病，但是它们并不是一直对机体有害，甚至在细胞内部信号传导方面起到很重要的作用。因此，如何能够设计一种智能的，具有环境刺激响应的GPx模拟物，目前是这一领域的研究热点。本论文采用大肠杆菌半胱氨酸营养缺陷型表达体系，以具有钙离子响应性的recoverin蛋白为骨架，构筑了一种全新的具有钙离子开关性能的智能GPx模拟物。1.构建硒代谷胱甘肽硫转移酶模拟GPx谷胱甘肽硫转移酶（GST）与谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）同属于硫氧还蛋白超家族，它们都具有相同的底物-谷胱甘肽（GSH）结合位点，因此，谷胱甘肽转硫酶无疑为一种很好的构建GPx模拟物的蛋白骨架。相对于天然GPx催化中心的硒代半胱氨酸，硒代甲硫氨酸中的硒醚结构具有更好的稳定性，如果能将硒代甲硫氨酸引入到蛋白质中，势必会得到一种稳定性更高，制备相对容易的高效GPx模拟物。为此，我们以日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶（sjGST）为骨架，利用其天然存在的GSH结合位点，采用大肠杆菌甲硫氨酸营养缺陷型表达体系首次将催化基团SeMet引入活性中心，制备出首个以SeMet为催化中心的GPx模拟酶。该酶展示出了很高的催化活力，其以GSH和过氧化氢（H2O2）为底物的GPx活力已达到了天然酶的水平。稳态动力学数据表明，这种以SeMet为催化中心的GPx模拟酶的催化机制为顺序机制。2、构建钙离子开关的智能GPx酶模型ROS在代谢过程中的过度积累会造成机体的多种损伤，但机体存在ROS代谢平衡时，ROS在某些信号传导的途径中起到很重要的作用。因此，设计一种智能的GPx模拟物，能够精确地调控ROS在体内的积累程度，是这一领域的科学工作者追求的目标。据我们所知，细胞内钙离子浓度变化与ROS浓度之间有着密切的联系，如果我们能够制备一种钙离子浓度响应的GPx模拟酶，那么就能实现对ROS浓度的响应。为此，我们从蛋白质数据库中寻找到了一种钙离子浓度响应的recoverin蛋白，钙离子的结合能够导致其三级结构的变化。我们利用大肠杆菌缺陷性表达体系将催化基团SeCys引入到这种蛋白中，制备了人工GPx模拟物—含硒recoverin（Seleno-recoverin）。通过钙离子调控蛋白质的空间结构变化，调控催化中心SeCys的埋藏与裸露，最终实现对催化活力的开关。3．抗氧化酶模拟物的生物学效应由于抗氧化酶重要的生物学特性，研制具有抗氧化能力的模拟物近年来引起科学家的极大关注。高效GPx模拟酶及钙离子开关的GPx模拟酶的构建不仅有助于阐明酶催化的机理以及酶结构与功能的关系，而且有可能成为未来预防和治疗由ROS介导的疾病的有效药物前体。我们针对钙离子开关的GPx模拟酶建立了两套体系（①Vc/Fe2+/MT；②罗丹明b /Fe2+/MT两种自由基诱生系统），分别从亚细胞水平和分子水平研究了它们的生物学效应，证明Seleno-recoverin具有很好的保护线粒体能力，而Seleno-recoverin的生物学效应则具有很好的钙离子调控能力。希望这些研究为开发预防和治疗心血管疾病和皮肤癌的新药前体奠定基础。