[目的]本课题以“肾主骨生髓”为理论依据,在前期研究的基础上,从去卵巢大鼠骨髓中分离出间充质干细胞建立体外培养系,结合细胞形态学、分子生物学技术,观察中药骨康方含药血清定向诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的能力,免疫组化、Western blot法测定成骨分化标志物的表达情况,运用RT-PCR技术检测测定成骨特异性转录因子Cbfal的表达,并进一步分析骨康含药血清诱导MSCs向成骨分化的可能信号机理,阐明P38信号通路机制在去卵巢大鼠(骨质疏松症病理状态模型)MSCs成骨分化中的重要作用。这将进一步阐明骨康在防治骨质量减少性疾病中的应用价值及其作用机理,为中医药调控干细胞治疗骨质疏松症的机理提供实验依据,为传统中医药走向世界提供实验数据。[方法]1.SPF级雌性Sprague-Dawley大鼠34只,其中10只用于制备骨康含药血清,14只切除SD大鼠双侧卵巢,造成大鼠去势,建立骨质疏松症模型,剩余为正常对照。2.由补骨脂,制淫羊藿,熟地,黄芪,菟丝子等十味中药组成的中药骨康方熬制中药汤剂,按人与大鼠体表面积比计算中药骨康方给药剂量,给予中药骨康方灌胃,于最后一次用药后2小时行心脏采血,制备含药血清。3.分别取4周龄SPF级正常SD大鼠10只和骨质疏松症模型大鼠12只,麻醉注射下,无菌条件下,分离出双股骨及胫骨,用D-Hank’s和DMEM液分别反复冲洗股骨和胫骨髓腔,提取和分离MSCs,以浓度为0.25%的胰蛋白酶(0.1ml/cm2)37℃条件下消化,以L-DMEM完全培养基,培养与传代MSCs,建立MSCs体外培养模型。4.实验分组：依次分为：No1：正常组对照；No2：正常组成骨诱导剂组(Control组+50μg/ml维生素C+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠+10-8mol/L地塞米松)；No3：正常组骨康组(骨康含药血清)；No4：去势组对照；No5：去势成骨诱导剂组；No6：去势骨康组。5.以茜素红染色检测各组的钙化结节情况,确定细胞外基质的矿物化；以放免分析方法测定细胞培养液中的骨钙素(BGP)含量；以免疫组织化学方法,检测成骨标记物ALP、OPN的表达情况,以确定成骨分化能力。6.以Western blot技术,检测P38蛋白、ATF-2的表达情况；用Real-Time PCR技术检测成骨标记物Runx2、P38蛋白、ATF-2的表达情况。7.统计方法数据用SPSS13.0软件包进行统计学分析,各组间比较采用t检验进行统计学处理。概率p<0.05表示在统计学上差异具有显著性。图像用计算机图像分析系统进行条带灰度值的分析。[结果]1.用放免分析方法对培养7d、14d后的细胞进行骨钙素(BGP)测定,N04(去势大鼠组)7d、14d检测的骨钙素(BGP)分别为3.98ug/L,4.31 ug/L,NO1(正常对照组)中骨钙素(BGP)分别为4.67 ug/L,4.85 ug/L,去势大鼠组均较正常对照组有明显的减少,有显著差异；对培养7d、14d后的细胞进行茜素红染色检测,检测钙化结节,确定细胞外基质的矿物化,N04(去势大鼠组)7d、14d检测的钙化结节数分别为1.16个,2.01个,NO1(正常对照组)中钙化结节数分别为1.67个,2.52个,去势大鼠组均较正常对照组有明显的减少,有显著差异；7天后行成骨标记物ALP、OPN的免疫组织化学染色,检测成骨标记物ALP、OPN的表达情况,以确定成骨分化能力,结果显示去势大鼠的成骨分化标记物ALP、OPN的阳性细胞数减少。2.通过放免分析方法对培养7d、14d后的细胞进行骨钙素(BGP)测定,N06(去势骨康组)7d、14d检测的骨钙素(BGP)分别为6.12ug/L,6.66 ug/L,N05(去势成骨诱导组)中骨钙素(BGP)分别为5.97 ug/L,6.94 ug/L,N04(去势对照组)中骨钙素(BGP)分别为3.98 ug/L,4.31 ug/L,去势诱导组与去势骨康组均较去势对照组有明显的增加,有显著差异；对培养7d、14d后的细胞进行茜素红染色检测,检测钙化结节,确定细胞外基质的矿物化,N06(去势骨康组)7d、14d检测的钙化结节数分别为3.12个,5.11个,N05(去势成骨诱导组)中钙化结节数分别为4.01个,5.79个,N04(去势对照组)7d、14d检测的钙化结节数分别为1.16个,2.01个,去势诱导组与去势骨康组均较去势对照组有明显的增加,有显著差异；7天后行成骨标记物ALP、OPN的免疫组织化学染色,检测成骨标记物ALP、OPN的表达情况,以确定成骨分化能力,结果显示去势骨康组、去势成骨诱导组的成骨分化标记物ALP、OPN的阳性细胞数显著增加。RT-PCR检测Runx2表达量：去势骨康组、去势成骨诱导组的Runx2表达量较去势对照组有明显增加,有显著性差异。3. Western blot检测成骨标记物P38、ATF-2的表达情况,去势大鼠组较正常大鼠组P38表达低,而骨康含药血清能上调P38的表达。ATF-2是P38的下游分子,主要调控细胞的增殖与凋亡,本实验中其表达趋势与P38相同；RT-PCR定量分析发现去势骨康方组的P38、ATF-2的表达与去势对照组相比,有显著差异。结论1、通过大鼠骨质疏松症动物模型的建立,以及含药血清的制备,对MSCs的分离、纯化培养及骨向诱导,成功地建立了中药骨康方体外骨向分化生物学细胞模型,建立研究中药骨康方对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化这一动态过程的调控机制的实验模型。2、实验发现去势大鼠组不同时间钙化结节数减少、骨钙素含量下降,成骨分化标记物ALP、OPN的阳性细胞数减少,表明去势大鼠MSCs成骨分化能力下降,进一步证明了绝经后骨质疏松发病原因是由于体内成骨前体细胞向成骨分化及成脂肪分化失衡的结果。3、实验发现去势骨康组BGP的含量均较去势对照组有明显的增加,有显著差异；去势骨康组钙化结节数均较去势对照组有明显的增加,有显著差异；去势骨康组的成骨分化标记物ALP、OPN的阳性细胞数显著增加,有显著性差异；RT-PCR检测Runx2表达量：去势骨康组的Runx2表达量较去势对照组有明显增加,有显著性差异。由此表明中药骨康方通过上调Cbfal表达,促进去势大鼠MSCs向成骨分化。4、实验发现Western blot检测成骨标记物P38、ATF-2的表达情况,去势大鼠组较正常大鼠组P38表达低,而骨康含药血清能上调P38的表达。ATF-2是P38的下游分子,主要调控细胞的增殖与凋亡,本实验中其表达趋势与P38相同。RT-PCR定量分析发现去势骨康方组的P38、ATF-2的表达与去势对照组相比,有显著差异。由此证明中药骨康方诱导去势大鼠骨质疏松MSCs成骨分化主要是通过激活了P38信号传导通路,并通过介导Cbfal活性和表达这一关键点从而发挥调控作用。5、从以上结果可以推测中药骨康方诱导去势大鼠骨质疏松MSCs成骨分化的调控机制是：骨康方→激活P38信号传导通路→MAPK转入核内→上调成骨细胞特异性转录因子Cbfal→结合成骨细胞特异性顺式作用元件2 OSE2→激活碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨桥蛋白及骨钙素等的表达→生物学效应→诱导MSCs成骨分化。