第一部分基于铁死亡相关基因的胆管癌预后模型的构建目的:胆管癌恶性程度高,致死性极强。铁死亡是一种铁依赖性脂质过氧化物积累致死的调节性细胞死亡方式。诱导铁死亡已成为潜在的肿瘤治疗策略。本研究旨在通过分析TCGA数据库和Ferr Db数据集,筛选胆管癌中表达差异的铁死亡相关基因（FRGs）,并构建胆管癌预后模型。方法:分析TCGA数据库中36例胆管癌患者的m RNA表达谱和相关临床数据,并结合Ferr Db数据集筛选表达差异的铁死亡相关基因（FRGs）;对铁死亡相关基因（FRGs）进行功能富集分析和蛋白质-蛋白质相互作用分析;通过最小绝对收缩和选择算子（LASSO）的Cox回归和逐步多元Cox回归构建预后模型,并用Kaplan-Meier生存曲线分析、ROC曲线、单因素和多因素Cox回归分析评估该模型的独立预后价值;分析该预后模型与免疫细胞浸润的相关性。结果:本研究共筛选出152个表达差异的铁死亡相关基因（FRGs）。其中,127个基因高表达,25个基因低表达。通过上述差异基因的GO和KEGG富集分析进一步阐明胆管癌铁死亡相关基因在胆管癌中功能意义。通过LASSO回归和逐步多元Cox回归成功构建由3个FRGs（BNIP3,GPT2,YWHAE）组成的预后模型。Kaplan-Meier生存曲线分析和ROC曲线分析显示该模型在预测胆管癌患者预后方面具有良好的敏感性和特异性。单因素和多因素Cox回归分析显示该模型具有独立预后价值。进一步研究发现,胆管癌FRGs死亡风险模型风险值与树突细胞、M1巨噬细胞和中性粒细胞浸润呈正相关,而与浆细胞和CD8+T细胞呈负相关。结论:本研究通过分析TCGA数据库和Ferr Db数据集,首次筛选了胆管癌中表达差异的FRGs,并构建了由3个FRGs（BNIP3,GPT2,YWHAE）组成的预后模型。该模型可以潜在的评估胆管癌患者远期生存风险,具有重要临床应用价值。第二部分胆管癌中14-3-3ε与肿瘤生物学行为关系的研究目的:14-3-3ε由铁死亡相关基因YWHAE编码,在胆管癌中的相关研究甚少。检测14-3-3ε在胆管癌组织中的表达情况,分析14-3-3ε与胆管癌临床病理特征的相关性,并探究14-3-3ε对胆管癌恶性生物学行为的影响。方法:采用免疫组化（IHC）、Western Blot和q RT-PCR等检测14-3-3ε在胆管癌组织和癌旁组织中的表达,卡方检验分析14-3-3ε与胆管癌病理分化程度、淋巴结转移情况和TNM分期的关系;Kaplan-Meier法分析14-3-3ε表达与胆管癌患者预后的关系;单因素和多因素Cox回归分析胆管癌患者预后的独立影响因素。采用慢病毒技术构建稳定高表达和低表达14-3-3ε的胆管癌细胞系,并利用体内外实验探索14-3-3ε与胆管癌肿瘤生物学行为的关系。结果:14-3-3ε在胆管癌组织中表达水平明显高于癌旁组织,并且与胆管癌淋巴结转移情况、T（45）（44）分期和组织分化密切相关。Kaplan-Meier分析显示14-3-3ε高表达组的胆管癌患者预后更差,而且多因素Cox回归分析提示14-3-3ε是胆管癌预后的独立危险因素。我们通过划痕实验、Transwell实验、EMT标志物检测和裸鼠肺转移模型发现,敲低14-3-3ε表达能够抑制胆管癌细胞的侵袭转移能力,而上调14-3-3ε表达能够促进胆管癌细胞的侵袭转移能力。我们通过体外成球实验、流式细胞检测、干性标志物检测和体内极限稀释成瘤实验发现,敲低14-3-3ε表达能够抑制胆管癌细胞的肿瘤干细胞特性,而上调14-3-3ε表达则相反。使用吉西他滨处理胆管癌细胞,14-3-3ε表达水平明显升高。CCK8实验发现,高表达14-3-3ε的胆管癌细胞的IC50值明显升高。结论:14-3-3ε在胆管癌中高表达,并与胆管癌淋巴结转移情况、TNM分期和病理分化密切相关,是胆管癌预后的独立危险因素。14-3-3ε与胆管癌的侵袭转移能力、肿瘤干细胞特性和化疗耐药紧密相关。第三部分14-3-3ε调控铁死亡的作用及其机制研究目的:胆管癌是一种高致死性疾病,其治疗手段有限。近期研究提示诱导癌细胞铁死亡有望成为一种新的治疗方法。但目前尚无研究探索铁死亡在胆管癌中的作用。本研究旨在探索14-3-3ε调控胆管癌铁死亡的作用及其机制研究。方法:利用铁死亡诱导剂（Erastin）和铁死亡抑制剂（ferrostatin-1和liproxstatin-1）共同处理验证Erastin是否诱导胆管癌细胞系Hu CCT1、RBE细胞和胆管癌耐药株Gem-Hu CCT1细胞发生铁死亡。利用CCK8实验、丙二醛（MDA）检测、Lipid ROS水平检测、谷氨酸释放试验、谷胱甘肽含量检测等分析14-3-3ε对Erastin诱导的胆管癌细胞铁死亡的影响。并通过Western Blot、q RT-PCR和免疫共沉淀实验（Co-IP）等探索14-3-3ε对Erastin诱导的胆管癌铁死亡的调控机制。结果:CCK8实验显示Erastin以剂量依赖性抑制Hu CCT1、RBE和Gem-Hu CCT1的细胞活性,而ferrostatin-1和liproxstatin-1能够逆转上述效应。其中GemHu CCT1对Erastin的作用更加敏感。Erastin处理条件下,Hu CCT1和RBE细胞中14-3-3ε的表达水平升高。上调14-3-3ε促进Erastin诱导RBE细胞发生铁死亡,细胞内MDA产生和Lipid ROS积累增加,而ferrostatin-1和liproxstatin-1可抑制其效应。敲低14-3-3ε则抑制了Erastin诱导的Hu CCT1细胞铁死亡,细胞内MDA产生和Lipid ROS积累减少。动物实验进一步证实,上调14-3-3ε促进了Erastin在裸鼠体内的抗肿瘤作用。进一步研究发现,上调RBE细胞中14-3-3ε表达后,谷氨酸的释放受到抑制,细胞内GSH含量下降、GSSG含量升高。而敲低14-3-3ε能够促进Hu CCT1细胞谷氨酸的释放,细胞内GSH含量升高、GSSG含量降低。上调RBE细胞中14-3-3ε表达后,SLC7A11在m RNA和蛋白水平的表达下降。14-3-3ε能够抑制Erastin诱导的SLC7A11蛋白表达升高。而敲低14-3-3ε可促进Erastin诱导的Hu CCT1细胞中SLC7A11蛋白表达升高。使用环己亚胺追踪法检测GPX4蛋白的半衰期,发现上调14-3-3ε显著缩短了Erastin处理后Hu CCT1细胞中GPX4蛋白的稳定期,而敲低14-3-3ε促进了Erastin处理后RBE细胞中GPX4蛋白的稳定性。CO-IP结果显示14-3-3ε蛋白和GPX4蛋白相互作用,而且上调14-3-3ε可以提高GPX4和14-3-3ε之间的相互作用。结论:Erastin能够诱导胆管癌细胞发生铁死亡,且耐药株细胞对Erastin诱导的铁死亡更加敏感。14-3-3ε促进Erastin诱导的胆管癌细胞发生铁死亡。14-3-3ε可以抑制system Xc-功能和SLC7A11表达;14-3-3ε可与GPX4蛋白相互作用并促进GPX4蛋白的降解。