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目的:衰老是指生物体生理器官随着年龄的增长发生不可避免的功能下降、内环境稳定能力降低、应激能力下降,机体结构、组分逐步退化,趋向死亡且无法逆转。衰老在机体正常发育、维持组织稳态和抑制肿瘤细胞增殖中起重要作用,老龄化也是癌症、心血管疾病、糖尿病和神经退行性疾病等人类疾病最主要的风险因素之一。因此了解衰老如何起作用,如何影响器官功能,以及如何预防、减缓衰老变得至关重要。间充质干细胞,又称多能干基质细胞（Mesenchymal Stem Cell,MSCs）,是多种人类疾病的治疗候选物,其治疗潜能源于这些细胞可迁移至组织区域并通过多向分化、分泌多种细胞因子等方式,发挥其免疫调节、促进组织修复等作用。近年来,不同种类的MSCs在各类衰老相关疾病的临床治疗和实验室研究中显示出强大的应用前景,且在老化相关衰弱症状及机体机能下降方面也展现出其独特的改善作用。但由于其抗衰老的分子机制尚不清晰,在临床应用中的质量控制、标准制定、风险把握等方面仍存在诸多问题,无法进行深度推广,因此明确其在延缓衰老过程中起作用的具体机制是目前亟需解决的问题。脂肪间充质干细胞（Adipose-derived Stem Cell,ADSCs）是从脂肪组织中提取的一类具有多向分化潜能和自我更新能力的成体多能细胞。因其具有体内存储量大、获取方便、体外培养及扩增简便等优势,迅速成为临床干细胞疗法的“热门细胞来源”,在全球的多项临床治疗中发现,ADSCs展现出强大的组织修复、抗炎、免疫调节等功能,同时课题组前期发现ADSCs条件培养基有促进皮肤胶原形成、抵御成纤维细胞光老化的作用。但针对ADSCs在延缓细胞、动物衰老方面报道较少且缺乏深入机制研究。为确证干细胞在治疗细胞衰老及延缓动物机体衰老方面是否具有真实作用,本研究利用小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse Embryonic Fibroblast,MEF）作为细胞复制性衰老模型、POLG knockin小鼠作为早衰动物模型,使用ADSCs对其进行细胞治疗,进行抗衰作用的验证,并由此探究其发生抗衰老的具体分子机制,为干细胞的临床应用与质量控制提供理论依据。研究方法:1、提取C57小鼠的胚胎成纤维细胞（MEF）和脂肪干细胞（ADSCs）,将二者利用Transwell细胞共培养体系进行细胞共培养;2、为检测ADSCs对MEF复制性衰老的延缓,分别利用细胞衰老β-半乳糖苷酶试剂盒、免疫荧光染色、Western blot以及CCK8等检测MEF细胞衰老和细胞活力相关情况;3、Seahorse细胞能量检测仪检测共培养后MEF细胞的细胞外酸化率（ECAR）和细胞氧消耗率（OCR）的变化;4、通过代谢组学技术检测共培养前后以及不同代数间MEF细胞代谢产物差异,并将所得数据进行相关生物信息学分析,然后利用STITCH线上数据库,对差异代谢产物进行进一步深度分析;5、Western blot检测共培养前后MEF细胞线粒体相关标记蛋白与自噬相关蛋白的表达;6、Mito SOX检测共培养前后MEF细胞线粒体ROS水平变化,流式细胞技术检测MEF细胞内ROS水平变化,JC-1染色检测线粒体膜电位变化,细胞免疫荧光共定位检测MEF细胞内线粒体自噬的激活;7、繁育POLG knockin小鼠,对其进行ADSCs规律注射治疗,观察其大体形态的变化;8、取小鼠心脏及脑组织进行衰老及自噬相关组织染色,并提取组织蛋白进行衰老相关蛋白检测。结果:1、ADSCs可有效延缓MEF细胞随传代发生的复制性衰老。在ADSCs的作用下,MEF细胞的β-半乳糖苷酶染色的蓝染细胞比例有明显降低,γH2AX提示其内DNA损伤水平也随之降低,Western blot检测衰老相关蛋白p16、p21、p53的蛋白含量明显减少,且结果均具有统计学差异;2、ADSCs影响了MEF细胞的活力与代谢平衡。通过CCK8细胞活力检测,在与ADSCs共培养后,MEF的细胞活力及增殖速率明显加快,同时,通过Seahorse细胞能量代谢实施测定仪检测OCR和ECAR,发现在ADSCs作用下MEF细胞的OCR和ECAR均呈下降趋势,细胞呼吸和ATP产生的基本水平降低,该趋势与细胞年轻化的趋势相同;3、代谢组学检测提示ADSCs可能影响了MEF细胞的线粒体功能。通过对MEF细胞代谢产物进行检测与分析,发现co-MEF-P4与MEF-P4组、MEF-P3与MEF-P4组间具有类似的差异代谢产物,使用STITCH在线分析相似差异代谢产物,发现其与细胞增殖、生物大分子合成及线粒体功能密切相关。4、ADSCs可促进MEF线粒体自噬,维系MEF细胞内环境稳态。通过Western blot检测,发现线粒体标记蛋白Tom20、Tim23、HSP60含量降低,线粒体ROS及细胞总ROS含量降低,线粒体膜电位JC-1明显提升,提示受损线粒体得到有效清除,线粒体质量得到改善。同时自噬标记蛋白P62减少,标志物LC3-I型减少,免疫荧光共定位检测得LAMP1和HSP60融合增强,提示细胞的线粒体自噬过程被激活。ADSCs通过促进线粒体自噬的激活,及时清除MEF内受损线粒体,提升线粒体的质量控制,调控MEF细胞内环境稳态。5、ADSCs可挽救线粒体功能障碍所致早衰小鼠的衰老进程:通过向POLG knockin小鼠进行ADSCs规律注射治疗,经过3次治疗后,小鼠体重较非治疗组有明显提升,脱发和驼背现象也有显著改善。通过小鼠心脏和脑组织的Western blot检测,配合组织切片的SA-β-gal活性测试和LC3免疫组织化学检测,验证了其可促进机体线粒体自噬并延缓衰老进程。结论:1、ADSCs可延缓MEF细胞的复制性衰老并提升其细胞活力、促进细胞增殖;2、在ADSCs的作用下,MEF细胞的细胞内环境稳态趋于平衡,大分子合成增强,代谢平衡由分解代谢向合成代谢转化,这一变化与MEF自然年轻态高度相似;3、ADSCs是通过激活MEF细胞线粒体自噬,对细胞线粒体质量和细胞内环境稳态进行改善,从而达到调节代谢平衡、延缓衰老的作用;4、同种异体ADSCs移植治疗可促进线粒体功能障碍早衰小鼠的自噬激活,并改善其早衰的表型。