【摘 要】
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黑色组曲霉(Aspergillus section Nigri)是按形态学分类标准从曲霉属(Aspergillus)中划分出的一类曲霉,最初因该分类中很多菌种具有产生多种酶以及应用于柠檬酸的工业生产而被广泛研究,后因该分类的许多菌种被报道可以产生赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)和伏马毒素B2(Fumonisin B2,FB2)等真菌毒素而被持续关注。此类菌主要污染的对象之一为葡萄及
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黑色组曲霉(Aspergillus section Nigri)是按形态学分类标准从曲霉属(Aspergillus)中划分出的一类曲霉,最初因该分类中很多菌种具有产生多种酶以及应用于柠檬酸的工业生产而被广泛研究,后因该分类的许多菌种被报道可以产生赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)和伏马毒素B2(Fumonisin B2,FB2)等真菌毒素而被持续关注。此类菌主要污染的对象之一为葡萄及其制品,并且被认定是葡萄酒中OTA污染的主要来源,并且有研究显示黑色组曲霉与葡萄酸腐病以及曲霉黑腐病等病害有关。本研究在2018及2019年两个年份对湖南省四个地区的处于成熟期的5个葡萄品种鲜果进行采样调查,用表皮分离法对葡萄鲜果表面黑色组曲霉的带菌率进行了调查统计;采用基于黑色组曲霉中钙调素(Calmodulin,CAM)基因进行鉴定菌种的方法以及利用高通量测序技术的宏基因组法对湖南地区黑色组曲霉的菌种种类以及种群结构进行统计分析;采用超高效液相色谱串联质谱技术(Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)对已鉴定的部分菌株进行赭曲霉毒素A和伏马毒素B2的产毒能力进行了测定,丰富了我国黑色组曲霉的相关研究,为评估我国葡萄表面黑色组曲霉及其毒素的污染风险提供参考。主要结果如下:1.本研究对湖南地区采集到的2820粒葡萄果实进行了黑色组曲霉带菌率调查统计,2018以及2019两年整体带菌率数值较为近似,分别为65.16%以及63.13%,在2018以及2019带菌率最高的地区均为常德地区。2018不同地区间的带菌率均有显著性差异;在2019,除常德地区与长沙地区之间无显著性差异外,其他地区之间均具有显著性差异。同一地区不同品种间部分具有显著性差异,采样前一个月的温度对葡萄表面黑色组曲霉的带菌率有显著性影响(p<0.05),降水有极显著影响(p<0.001)。2.对已从表皮分离得到的菌株基于Calmodulin基因序列进行比对,在湖南地区总共分离鉴定得到了共计9个黑色组曲霉菌种,分别为A.tubingensis、A.niger、A.welwitschiae、A.brunneoviolaceus、A.aculeatinus、A.aculeatus、A.japonicus、A.indologenus、A.uvarum,共有10个单倍型。其中优势菌种为A.tubingensis,A.brunneoviolaceus中有两个单倍型。共计分离鉴定得到2921株黑色组曲霉,其归属于3个黑色组曲霉复合群。分别为A.tubingensis clade、A.aculeatus clade以及A.welwitschiae clade,其中A.tubingensis clade中菌株数量最多。在常德、长沙、岳阳以及怀化四个地区中,怀化地区分离得到的菌种种类最多,共得到8种。长沙地区的可能产真菌毒素的菌种数量占比最高,各地区的菌种结构与复合群结构均有显著性差异。3.宏基因组方法共鉴定得到19种真菌,其中包含5种黑色组曲霉,黑色组曲霉分别为A.tubingensis、A.aculeatus、A.welwitchiae、A.niger以及A.luchuensis。检测得到频率最高的为菌种A.tubingensis以及A.aculeatus。与传统方法在菌种类型与菌种比例上与表皮分离法的结果均有差异,但在复合群类型和比例上,部分与分离法一致,可以基于更完整的真菌基因库继续探索。4.对菌种A.tubingensis、A.welwitschiae以及A.niger进行了产赭曲霉毒素A以及伏马毒素B2的检测,两年共计检测了426株黑色组曲霉。在两年均未检测到可产生OTA的菌株,共有210株菌株可产生FB2。两种毒素未在菌种A.tubingensis检测得到。菌种A.niger的全部菌株均可产生FB2,平均产毒量分别为4586.62 ng/g以及6939.19ng/g,菌种A.welwitschiae的产毒比例分别高达76.47%和85.48%,平均产毒量分别为5622.38 ng/g以及9961.05 ng/g,且菌种A.welwitschiae的平均产毒量高于A.niger。两个菌种的菌株在产毒量分布区间上,均在两端的产毒量区间分布较多。
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