研究目的:　　随着社会的发展以及人们生活习惯等的改变，我国的糖尿病发病率已达到了9.6％，而糖尿病恰恰是下肢动脉硬化闭塞最高危的因素之一，目前成人外周动脉疾病(PAD)的发病率以及达到3-10％，而其中约有四分之一的患者是年龄较大或合并有其他脏器功能较差而无法耐受外科手术甚至是介入治疗。PAD主要包括下肢动脉粥样硬化闭塞症（下肢ASO）、血栓闭塞性脉管炎(TAO)和糖尿病足(DF)。轻者主要表现为间歇性跛行，重者可导致截肢甚至死亡，严重影响着人们的生活质量。以致近年来下肢动脉硬化闭塞的治疗进展越来越受到人们的关注。我们知道早期对于下肢动脉的治疗主要是药物保守治疗和外科手术，但药物治疗往往只是效果甚微，而一部分患者又无法耐受手术。近些年随着腔内技术的发展，人们似乎以为微创介入就是下肢动脉硬化闭塞症的根治术，甚至专家们在腔内介入治疗可以作为部分下肢动脉硬化闭塞症治疗的首选方法方面已达成共识。事实表明腔内介入以其安全、微创、可重复性等优势已经和传统的旁路术并驾齐驱。但多年的临床实践结果表明腔内治疗的最大缺陷就在于治疗后的再狭窄，以及对一些微小血管爱莫能助。因此为了更加有效的治疗甚至可以说是根治下肢动脉硬化闭塞症这一难题，除了研发能抑制血管内膜增生相关药物以外，相关领域一直在探索研究有效的细胞水平和分子水平的治疗。　　早在1996年，Isner曾首次运用VEGF基因治疗1例血栓闭塞性脉管炎患者，3个月后观察到新生侧枝血管的生成，开创了基因治疗的先例。随后国外大量学者开始了对基因治疗下肢血管硬化闭塞症的研究，但结果都不太理想。随着探索发现早期的基因治疗主要以目的基因裸质粒注射至缺血部位，但后来发现这种治疗方式目的基因的表达太低，加上本身的降解，使得疗效甚微而逐渐被人们所放弃。近10年人们开始用一种能在人细胞中持续表达的载体与目的基因重组后注射到缺血部位。目前人们选用重组基因的载体主要有脂质体和病毒两种。病毒作为载体，转染效率高，但考虑到机体的免疫反应从而限制了其在临床上的使用，而用脂质体作为载体虽然安全，但转染效率一直是学界普遍无法解决的难题。　　笔者曾用不含信号肽的VGFE重组质粒转染HEK293细胞后发现转染效率只有15％左右。所以，如何提高脂质体法转染效率可能是解决基因治疗的关键点。研究目的:　　1、重新构建含有信号肽序列的pcDNA3.1(-)-VEGF165重组质粒的可行性，为提高脂质体法转染效率寻找一种新的改进方法。　　2、进一步验证含信号肽的pcDNA3.1(-)-VEGF165重组质粒和不含信号肽的重组质粒在大鼠缺血后肢中促进新生血管的可行性及两者的差异。　　3、为基因治疗应用于临床实践奠定基础。　　研究方法:　　本实验先通过构建含有信号肽的pcDNA3.1（-）-VEGF重组质粒，然后分别用该质粒和不含信号肽的重组质粒转染人胚肾上皮细胞(HEK293)从而验证改进的质粒能否提高转染效率，并通过进一步检测不含信号肽的VEGF质粒组、含信号肽的VEGF165质粒组在体内促进血管新生的可行性及两者的差异。　　研究结果:　　1.成功构建了含有信号肽的pcDNA3.1(-)-VEGF重组质粒。　　2.不含信号肽的转染组转染HEK293，72h后约有15-20％左右的HEK293细胞表达ZsGreen，效率低下。　　3.脂质体法介导VEGF165质粒转染组HEK293细胞中VEGF165表达较未转染组增多，不含信号肽的重组质粒组与含信号肽的质粒组VEGF165蛋白水平无明显差异。　　研究结论:　　构建含信号肽的pcDNA3.1-VEGF165重组质粒确实可行。不管是含信号肽的重组质粒组还是不含信号肽的重组质粒组均较未转染组VEGF蛋白表达率均高。但两转染组之间胞内蛋白表达无明显差异，含信号肽的重组质粒影响细胞的定位表达。