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背景与目的:痛风(gout)是尿酸或尿酸盐(monosodium urate,MSU)晶体沉积于全身关节及其关节周围组织或器官而引起以高尿酸血症、急慢性痛风性关节炎、痛风石、尿酸性尿路结石以及尿酸性肾病为主要表现的一组临床综合征。近年来,在全球范围内痛风的发病率和患病率呈逐年升高趋势,且有年轻化趋势。流行病学资料显示,欧洲痛风患病率达1.4%,而我国痛风患病率1%~3%。高尿酸血症是痛风发生的生化基础和最直接原因。研究证实,MSU可作为DAMPs激活TLRs介导的免疫炎症信号通路,释放IL-1β、TNF-α、IL-6等致炎因子。痛风区别于其它自身炎症性疾病或自身免疫性疾病的显著特征之一是急性发作后7~10天后可自行缓解,痛风这一特征的具体分子机制尚不清楚,是目前痛风发病机制中急需解决的问题之一。micro RNAs是一类长度约为18-25nt的内源性高度保守的非编码小RNA,它通过与靶基因的3’-UTR结合,形成RNA诱导的沉默复合体,来降解m RNA和/或抑制靶m RNA转录后翻译。mi RNAs在炎症反应的调节作用受到广泛的关注。近年来,越来越多的研究发现,mi RNAs在痛风发病过程中发挥重要作用。本课题组前期研究发现,mi R-150在MSU刺激的野生型小鼠骨髓诱导的巨噬细胞中呈高表达,提示mi R-150可能参与MSU诱导的炎症反应。中医认为痛风属于“痹症”范畴,是因脾胃运化功能失常所致。湿热瘀阻型和痰瘀互结证是痛风急性发作期最常见的证型,其治疗以清热利湿为主,而虎杖具有清热利湿的效果。近年来,发现虎杖提取物白藜芦醇具有通过调节细胞信号通路和mi RNAs来发挥抗炎作用而被广泛关注。有研究显示,白藜芦醇可能通过抑制NF-κB的活化来调控TLR4信号通路来抑制巨噬细胞分泌细胞因子发挥抗炎作用,但具体机制还有待进一步研究。本课题拟通过研究痛风患者mi R-150的变化情况、mi R-150调控痛风炎症机制以及白藜芦醇调控痛风炎症的机制探讨mi R-150在痛风炎症中的作用。材料与方法:1.收集痛风(其中,急性期60例(acute gout,AG)、间歇期60例(intercritical gout,IG)患者)和同期体检的48例健康体检者(health control,HC)外周静脉血标本以及临床和实验室资料,其中。采用RT-q PCR检测痛风患者外周血单个核细胞中mi R-150、SOCS1、STAT3、NF-κB P65 m RNA表达水平,Western blot检测痛风患者PBMCs中SOCS1、p-STAT3和p-NF-κB P65蛋白水平,并通过相关性分析mi R-150与实验室资料的相关关系。2.利用生物信息学分析并鉴定THP-1细胞中mi R-150的靶分子(1)结合文献查阅及利用生物信息学软件Target Scan、mi Rbase、RNAhybrid 2.2预测,筛选出与痛风炎症相关的mi R-150靶分子;(2)构建作用靶点双荧光素酶报告载体,与mi R-150 mimic(过表达)共转染至293T细胞中,观察mi R-150是否能与靶基因3’-UTR区中预测位点结合;(3)mi R-150 mimic(过表达mi R-150)和mi R-150 inhibitor(抑制mi R-150表达)共转染THP-1细胞,采用RT-q PCR法检测mi R-150和SOCS1 m RNA的表达,运用Western blot法检测SOCS1蛋白的水平。3.mi R-150 mimic/inhibitor对MSU刺激THP-1巨噬细胞炎症的影响(1)mi R-150 mimic/inhibitor转染THP-1细胞48h后予以100ng/ml PMA诱导分化24h,再予以100μg/ml的MSU刺激6h后收集细胞和上清液;(2)采用流式细胞术检测经(1)中处理后细胞凋亡情况;RT-q PCR法检测mi R-150、SOCS1 m RNA水平;Western blot法检测SOCS1、p-STAT3、p-NF-κB p65蛋白水平;采用ELISA法检测上清液中细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6的表达水平;4.白藜芦醇及SOCS1 si RNA对MSU刺激THP-1巨噬细胞炎症的影响(1)白藜芦醇单独或联合SOCS1 si RNA干预100μg/ml MSU刺激经100ng/ml PMA诱导分化的THP-1细胞,收集细胞和上清液;(2)采用流式细胞术检测经(1)中处理后的细胞凋亡情况;RT-q PCR检测SOCS1 m RNA水平;Western blot法检测SOCS1、p-STAT3、p-NF-κB p65蛋白水平;采用ELISA法检测上清液中细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6的表达水平;5.采用SPSS13.0统计软件包及Graph Pad Prism 5对所有数据进行分析统计,基因表达以2^(-??CT)表示,结果以均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),进一步组间两两比较采用t检验(Bonferroni法),相关性分析采用Spearman。P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.与健康对照组比较,痛风患者除炎症指标如WBC、GR、ESR和CRP外,与代谢相关的多个指标如血尿酸、BMI、血脂、血糖、血压均显著增高(P<0.01或P<0.05);2.AG组患者外周血单个核细胞中mi R-150显著低于IG组和HC组(P均<0.05),而IG与HC组之间差异无统计学意义(P>0.05);3.利用生物信息学在线软件预测到SOCS1为mi R-150的靶基因;通过构建含有mi R-150作用靶点的双荧光素酶报告载体,证实了mi R-150能与SOCS1 m RNA上预测的结合位点结合;通过转染mi R-150 mimic/inhibitor至THP-1细胞后,结果发现,与Blank组比较,mi R-150 mimic组mi R-150显著上调(P<0.01),而mi R-150inhibitor组mi R-150显著降低(P<0.01);与Blank组比较,mi R-150mimic组SOCS1 m RNA和蛋白的表达水平显著下降(P<0.01),而mi R-150 inhibitor组SOCS1 m RNA和蛋白的表达水平显著升高(P<0.01)。4.mi R-150对MSU刺激THP-1巨噬细胞炎症的影响:(1)RT-q PCR结果显示mi R-150在MSU刺激的THP-1巨噬细胞中表达显著增加(P<0.01);RT-q PCR和Western blot结果显示SOCS1 m RNA和蛋白水平在MSU刺激的THP-1巨噬细胞中显著降低(P<0.05);上清液中细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白表达水平显著增加(P均<0.01)(2)mi R-150过表达时,RT-q PCR及Western blot结果显示SOCS1m RNA和蛋白表达水平均显著下调(P均<0.01),Western blot结果显示p-NF-κB和p-STAT3蛋白表达显著升高(P均<0.05);ELISA结果显示细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6表达水平显著增加(P均<0.01);而mi R-150表达抑制时,结果显示SOCS1m RNA和蛋白表达水平均显著增加(P均<0.01),而p-NF-κB和p-STAT3蛋白表达显著下降(P均<0.05);上清液中细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6表达水平显著降低(P均<0.01);(3)AG组和IG组PBMCs中SOCS1 m RNA和蛋白均显著低于HC组(P<0.01,P<0.05),且AG组显著低于IG组(P<0.05)。AG组STAT3和NF-κB p65 m RNA水平显著高于IG组和HC组(P<0.05,P<0.01),AG组p-STAT3和p-NF-κB p65蛋白水平显著高于IG组和HC组(P均<0.01)5.流式细胞术结果显示不同浓度的白藜芦醇、白藜芦醇单独或联合SOCS1 si RNA组细胞活性均大于96%,凋亡率小于5%,说明白藜芦醇联合MSU和SOCS1 si RNA以及不同浓度白藜芦醇联合MSU刺激THP-1细胞对细胞活性无显著影响(P均>0.05)。6.不同浓度(0,25,50,100μM)Res联合MSU刺激THP-1细胞后,结果发现mi R-150在各组间差异无统计学差异(P>0.05)。Res50μmol/L、100μmol/L联合MSU组SOCS1 m RNA和蛋白表达水平较MSU组显著增加(P均<0.05),且SOCS1的表达水平呈现浓度依赖性;同时我们发现Res 50μmol/L、100μmol/L联合MSU组NF-κB p65 m RNA和p-NF-κB p65蛋白水平较MSU组显著下降,且随着Res浓度增加下降越明显(P<0.05,P<0.01);7.不同浓度(0,25,50,100μM)Res联合MSU刺激THP-1细胞后,结果发现Res 50μmol/L、100μmol/L联合MSU组IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白表达水平较MSU组显著下降(P均<0.01),且随着Res浓度增加而下降;8.SOCS1 si RNA联合MSU刺激THP-1细胞后,与MSU组比较,SOCS1 m RNA和蛋白水平显著下降(P均<0.01),而p-NF-κB p65和p-STAT3蛋白表达水平显著增加(P均<0.01);9.与Res100+MSU组比较,SOCS1 si RNA组中SOCS1的m RNA和蛋白表达水平显著下降(P均<0.05),而p-NF-κB p65和p-STAT3蛋白表达水平明显增加(P均<0.05);上清液中IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白表达水平显著增加(P均<0.01)。与SOCS1 si RNA联合MSU组比较,SOCS1 si RNA+Res100+MSU组SOCS1 m RNA和蛋白表达水平增加(P均<0.01),而p-NF-κB p65和p-STAT3蛋白表达水平明显下调(P均<0.01);上清液中IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白表达水平显著降低(P均<0.01)。小结:1.除炎症指标如WBC、GR、ESR、CRP外,痛风患者代谢指标如BMI、血压、血糖、血脂等多项实验室指标均高于健康对照者,说明痛风患者容易伴发代谢相关性疾病。2.mi R-150在痛风患者PBMCs中和MSU诱导的巨噬细胞炎症反应中表达异常,提示mi R-150可能参与了痛风的发病。3.预测并验证了SOCS1为mi R-150靶分子;并通过转染实验发现SOCS1 m RNA和蛋白水平能够被mi R-150抑制,提示mi R-150可能通过降解SOCS1 m RNA而发挥抑制作用。4.SOCS1在痛风患者和MSU诱导的炎症反应中表达显著降低,而STAT3、NF-κB p65 m RNA和p-STAT3和p-NF-κB p65蛋白水平在痛风患者和MSU诱导的炎症反应中显著增加,提示SOCS1、NF-κB和STAT3信号通路可能参与痛风发病过程。5.mi R-150可能通过下调SOCS1的表达,进而促进NF-κB信号通路和STAT3的活化,使炎症因子分泌增多,进而加重炎症反应。6.白藜芦醇通过上调MSU诱导的THP-1巨噬细胞炎症反应中SOCS1的水平,降低p-NF-κB p65和p-STAT3以及炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6水平的降低,SOCS1 si RNA抑制SOCS1的表达后能逆转白藜芦醇的这种抑制效应,提示白藜芦醇调控NF-κB和STAT3的活化来抑制MSU诱导的痛风炎症反应可能是通过上调SOCS1的表达实现的。